Regulación por proteínas señalizadoras de la adhesión dependiente de integrinas linfocitarias en respuesta a quimioquinas

Resum

Las quimioquinas promueven la migración de células inmunes desde la circulación linfática y sanguínea a tejidos linfoides y sitios de inflamación, tras una rápida y transitoria estimulación de la actividad de las integrinas alpha4beta1 y alpha2betaL por quimioquinas presentes en el endotelio. En esta tesis hemos centrado nuestros estudios en la caracterización este proceso conocido como señalización inside-out, requerido para la estimulación por quimioquinas de la adhesión de células T dependiente de alpha4beta1. El primer objetivo de la tesis consistió en estudiar el papel de la quinasa ZAP-70 en la regulación de la dinámica de las asociaciones entre Vav1, talina y beta1, evento clave para la activación de la adhesión celular mediada por alpha4beta1. Nuestros datos sugieren que Vav1 funciona como una molécula represora de talina, que necesita ser fosforilada por ZAP-70 para ser liberada de su asociación con talina, dejando a la talina accesible para llevar a cabo la activación de la integrina alpha4beta1. A continuación, analizamos el papel de proteínas relacionadas con Vav1, como SLP-76, Pyk2 y ADAP, en la regulación por quimioquinas de la adhesión de células T mediada por alpha4beta1. Los efectos en adhesión de células silenciadas para SLP-76, ADAP y Pyk2 no fueron debidos a alteraciones en la adquisición de conformaciones de alta afinidad de alpha4beta1, sino a problemas en el reforzamiento de la adhesión y en el spreading celular. De este modo, observamos una disminución del reforzamiento de la adhesión y del spreading en células silenciadas para ADAP, y un aumento de estos procesos en células deficientes en Pyk2. En cambio, el silenciamiento de SLP-76 únicamente afectó el spreading celular. De forma notable, el silenciamiento de Pyk2 se tradujo en un incremento de la activación de Rac y de la polimerización de actina asociado con el aumento en el reforzamiento de la adhesión y el spreading, sugiriendo que estos procesos están involucrados en la regulación por Pyk2 de la adhesión de células T dependiente de alpha4beta1. Nuestros datos muestran que tanto ADAP, como SLP-76 funcionan como activadores de la adhesión mediada por alpha4beta1 en células T en respuesta a CXCL12, mientras que Pyk2 tendría una función represora. Finalmente, estudiamos el papel de RGS10, proteína aceleradora de la actividad GTPasa intrínseca de las subunidades Galpha de la proteína G heterotrimérica, en la mencionada adhesión. Mediante el silenciamiento o sobreexpresión de RGS10 mostramos que funciona como un inhibidor de la adhesión mediada por alpha4beta1 y alpha2betaL en células T en respuesta a CXCL12, ejerciendo su función principalmente en las fases de reforzamiento y spreading celular de la adhesión mediada por alpha4beta1. Asociado a estos resultados observamos un incremento en la duración e intensidad de la activación de la vía Vav1-Rac1 en respuesta a quimioquinas en células silenciadas para RGS10, mientras que cuando sobre-expresamos RGS10 esta activación se vio inhibida. En conjunto, nuestros datos sugieren que RGS10 se opone a la activación en células T de la vía Vav1-Rac en respuesta a quimioquinas, generando una pérdida en el reforzamiento de la adhesión dependiente de alpha4beta1, siendo RGS10 una molécula clave en la terminación de la señalización dependiente de Galphai durante la activación de la adhesión de células T mediada por alpha4beta1 y alpha2betaL en respuesta a quimioquinas. Como conclusión de los resultados del trabajo realizado, podría separarse a las proteínas en activadoras, como ZAP-70, SLP-76 y ADAP, y como represoras, como Pyk2 y RGS10, de la adhesión mediada por alpha4beta1 en células T en respuesta a CXCL12.