Pyridazine hybrids with potential application in aging disorders

Résumé

A pesar de los continuos avances tecnológicos y científicos orientados a mejorar la calidad de vida, el número de medicamentos aprobados en la actualidad para el tratamiento de patologías con una alta incidencia como las enfermedades neurodegenerativas y el cáncer, sigue descendiendo. De esta forma, han surgido nuevas estrategias para el descubrimiento de fármacos, como pueden ser el diseño de medicamentos asistidos por ordenador, técnicas basadas en química combinatoria o nuevos métodos de evaluación farmacológica in vitro e in vivo, entre otros. Además, técnicas como la hibridación molecular permiten la obtención de nuevas entidades químicas (moléculas híbridas) mediante la combinación de dos o más unidades farmacofóricas de diferentes compuestos bioactivos. Así, es posible sintetizar una amplia librería de compuestos con una mejor afinidad y eficacia con respecto a los productos de partida Por otro lado, los productos naturales, en especial aquellos que contengan heterociclos, han proporcionado una plataforma muy útil para la obtención de derivados con una amplia aplicación terapéutica y por lo tanto algunos de ellos como la piridazina, son estructuras privilegiadas para el descubrimiento de fármacos. El principal objetivo de esta tesis es, por lo tanto, analizar el potencial farmacológico de una serie de compuestos híbridos, en los cuales el anillo de piridazina está incluido en estructuras cumarínicas, guanidínicas y estilbénicas, frente una serie de trastornos propios del envejecimiento como son las enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y el cáncer. La piridazina es un heteroareno que posee dos átomos de nitrógeno en posiciones adyacentes, lo cual le aporta unas propiedades específicas en términos de polaridad y capacidad para formar enlaces de hidrógeno y puede también explicar su solubilidad en disolventes polares tales como alcoholes y agua. Sus derivados tienen un amplio espectro de actividades biológicas entre los que destacan un gran número de compuestos con actividad antidepresiva, antiviral, broncodilatadora, cardiotónica, antiplaquetaria, antihipertensiva, analgésica y antiinflamatoria, antidiabética, neuroprotectora o antineoplásica. La síntesis de este tipo de compuestos está ampliamente documentada en la bibliografía y ha sido objeto de un gran número de revisiones. Así, múltiples productos de partida pueden ser utilizados para llevar a cabo la construcción de anillo piridazinónico y entre ellos, caben destacar la reacción de compuestos 1,4-difuncionalizados, la reacción de arilhidrazinas o arilhidrazonas que permiten generar N-arilpiridazinonas e incluso la condensación de α-cetoésteres con el éster etílico del ácido hidrazinocarbonilacético. Además, hay que tener en cuenta que muchos de los derivados descritos en la bibliografía incluyen un grupo arilo en la posición C6 del anillo debido al interés farmacológico que surge de este tipo de sustitución. De esta forma, múltiples reacciones de condensación de hidrazina o hidrazinas sustituidas con -lactonas o compuestos 1,4-dicarbonilicos se han utilizado para sintetizar derivados de 6-fenilpiridazin-3(2H)-onas. En los últimos años se han descrito nuevos métodos sintéticos, entre los cuales, algunos están relacionados con la química verde, como por ejemplo la ausencia de catalizadores o aditivos y el uso de agua como disolvente; y otros están basados en la anulación oxidativa de aldehídos α,β-insaturados catalizada por carbenos, lo que permite la síntesis selectiva de compuestos ópticamente activos. Por otro lado, las cumarinas, también conocidas como benzopiran-2-onas, son una importante familia de heterociclos que poseen un amplio espectro de actividad y debido a su diversidad estructural, éstas van desde simples cumarinas sustituidas hasta cumarinas policíclicas, fusionadas o polisubstituidas. Las cumarinas tienen un amplio espectro de aplicaciones en diferentes campos, tales como la cosmética y la industria alimentaria, la agroquímica y la química de materiales, así como en la química médica donde muchos derivados están siendo desarrollados como fármacos debido a su perfil farmacológico y farmacocinético. Además, es importante resaltar la versatilidad de este tipo de compuestos para el diseño de fármacos, ya que diferentes patrones de sustitución han dado lugar a análogos con diversas actividades farmacológicas, incluyendo agentes antiinflamatorios, antiplaquetarios, anticoagulantes, vasodilatadores, antioxidantes, antivirales, antibióticos, neuroprotectores o anticancerígenos. La cumarina fue sintetizada por primera vez por Perkin en 1868 mediante su reacción clásica a partir de salicilaldehído. A lo largo de los años, muchos otros métodos como las reacciones de Wittig, Kostanecki-Robinson, Reformatsky y Baylis-Hillman han surgido para la formación del anillo de cumarina, sin embargo, la reacción de Perkin sigue siendo ampliamente utilizada y el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos basados en la estructura de cumarina sigue siendo un tema de gran interés en la química médica. La mayoría de estos procedimientos sintéticos son costosos, necesitan largos tiempos de reacción e incluso requieren una purificación laboriosa. Por lo tanto, en la actualidad, se ha llevado a cabo una mejora de las metodologías clásicas mediante el uso de la catálisis con metales de transición, catálisis heterogénea, el uso de líquidos iónicos, síntesis en fase sólida e incluso reacciones en fase acuosa. Finalmente, los estilbenos son moléculas pequeñas de origen natural o sintético con una estructura general de 1,2-difeniletileno (cis o trans) que poseen un gran interés químico y médico Un gran número de estilbenos naturales son compuestos fenólicos, entre ellos el resveratrol, la combretastatina A4 y el pterostilbeno son los ejemplos más conocidos. Estos compuestos, debido a su amplia gama de propiedades biológicas, que incluyen efectos antiinflamatorios, anticancerígenos, antivirales, antioxidantes, cardioprotectores y neuroprotectores, han inspirado el diseño de muchos otros análogos. Así, como consecuencia de la amplia versatilidad de los derivados de estilbeno, se han desarrollado múltiples metodologías sintéticas para su obtención, siendo la formación de enlaces C=C entre las que destacan las reacciones de Wittig, Horner-Wadsworth-Emmons, la olefinación de Julia y la reacción de Perkin; y la arilación de alquenos como el uso de acoplamientos de Suzuki, Heck o Negishi, los principales métodos descritos. Por otro lado, el incremento de la longevidad media en los países desarrollados ha motivado la aparición de alteraciones que no pueden plantearse como enfermedades convencionales, pero que constituyen problemas socio-sanitarios y requieren alternativas terapéuticas. Dentro de los trastornos propios del envejecimiento destacan los provocados por causas vasculares o neurodegenerativas y el cáncer cuyo origen reside en procesos inespecíficos y hace necesaria la investigación en este tipo de patologías y sus tratamientos. Nuevos híbridos de piridazina con potencial aplicación en el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, han sido diseñados y sintetizados para alcanzar nuestros objetivos. Las diferentes series de compuestos han sido ensayados, de acuerdo con su estructura, en diferentes tipos de estudios in vitro para determinar su potencial utilidad terapéutica y establecer una relación estructura-actividad. Así, se han llevado a cabo estudios de inhibición de la agregación plaquetaria, inhibición de la monoamino oxidasa y estudios citotóxicos frente diferentes líneas celulares cancerosas. En primer lugar, se llevó a cabo la síntesis de una serie de 77 híbridos cumarina-piridazina funcionalizados tanto en el anillo de cumarina como en el de piridazina. Para ello, se siguió una metodología sintética basada en la reacción de Knoevenagel entre los correspondientes intermedios piridazinónicos 5-7 y diferentes o-hidroxialdehídos comerciales. Estos intermedios fueron obtenidos previamente a partir de anhídrido maleico en una secuencia de cuatro etapas que incluye una reacción de Diels-Alder, Wittig y retro Diels-Alder seguida de ciclación con hidracina, metilhidracina o bencilhidracina. Una vez obtenidos los híbridos cumarina-piridazinona 8-43, se llevó a cabo la funcionalización del anillo de piridazina tomando los derivados 32-43 como material de partida. Así, mediante tratamiento con POBr3 o POCl3 se pudieron obtener los correspondientes análogos bromados (44-55) y clorados (56-67). Además, estos últimos fueron transformados en los metoxi derivados (68-79) y en los híbridos de tetrazol (80-84), cuya estructura fue inequívocamente determinada mediante el análisis de difracción de rayos X del monocristal obtenido. A continuación, para obtener la Mención Internacional, fue necesario realizar una estancia de 3 meses en el grupo que dirige la Profesora Isabel Rozas en el Trinity College de Dublín. El objetivo de esta estancia ha sido la familiarización con la química de las guanidinas a través de su incorporación sobre distintos esqueletos de piridazinona, con la idea de desarrollar nuevos fármacos y realizar un posterior análisis utilizando experimentos biofísicos como los de desnaturalización térmica del ADN y dicroísmo circular; y bioquímicos como es el caso de los ensayos en diferentes líneas celulares cancerosas. Para ello, se ha llevado a cabo la síntesis de una serie de híbridos monoguanidina-piridazinona utilizando los butenólidos 93-96, previamente funcionalizados con una cadena metilénica en diferentes posiciones del anillo, como intermedios clave, para generar las piridazinonas deseadas mediante ciclación con metilhidracina o bencilhidracina. Estas últimas, mediante una secuencia sintética que incluye desprotección, bromación y posterior tratamiento con 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)guanidina fueron transformadas en los derivados guanidínicos 148-154, a partir de los cuales se generaron las correspondientes sales de guanidinio 162-168 mediante hidrólisis ácida con HCl. Además, teniendo en cuenta la gran actividad que presentan algunos derivados bisguanidínicos descritos en la bibliografía, se ha llevado a cabo la síntesis y el estudio de actividad biológica de una serie de híbridos bisguanidina-piridazinona, para lo cual fue necesario seguir una metodología similar a la empleada anteriormente. Así, las piridazinonas 97-100, susceptibles de alquilación en N2 han sido utilizadas como precursores de los híbridos bisguanidina-piridazinona. En este caso, dos estrategias análogas que difieren en el agente alquilante seleccionado fueron utilizadas para sintetizar los intermedios clave. Así, la N-alquilación de las piridazinonas 97-100 con α,α’-dibromo-p-xileno y 4-(bromometil)benzoato de metilo permitió la obtención de los intermedios 108-114, sin embargo, sólo los derivados de éster 111-114 condujeron a los productos deseados. A continuación, mediante una estrategia sintética de tres etapas que incluye la reducción del grupo éster con DIBAL-H, la desprotección del grupo TBDPS y la bromación del alcohol, se obtuvieron los derivados bromados 141, 143, 145 y 146, a partir de los cuales mediante tratamiento con 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)guanidina seguido de hidrólisis ácida, se generaron con buen rendimiento los híbridos bisguanidina-piridazinona 169, 172-174 deseados. Finalmente, dos rutas diferentes fueron utilizadas para la síntesis de híbridos de estilbeno-piridazinona. Para ello, fue necesario la síntesis previa de los sintones piridazinónicos 185 y 186 como intermedios clave. De esta forma, las piridazinonas 185 y 186 se construyeron utilizando el β-cetoester 176 como material de partida, cuyo tratamiento con cloruro de fenildiazonio o por reacción con una arilsulfonil azida permitió generar los compuestos 177 y 178 respectivamente. A continuación, el anillo de piridazinona en el compuesto 179 se generó a partir de la hidrazona 177 mediante un cierre térmico del anillo, mientras que para sintetizar el compuesto 180 a partir de 178 se utilizó una secuencia que implica una reacción inicial de Staudinger con trifenilfosfina, seguida por una hidratación y ciclación en medio ácido. Para llevar a cabo la conversión de los ésteres 179 y 180 en los aldehídos 185 y 186, fue necesaria una protección de los grupos fenol y NH previa a la reducción con NaBH4 y la subsiguiente oxidación catalizada por TEMPO. Los diferentes híbridos de estilbeno-piridazinona 199-205 se sintetizaron mediante una reacción de Wittig entre los aldehídos 185 y 186 y la correspondiente sal de trifenilfosfonio previamente sintetizadas. La mayoría de los productos generados de esta reacción fueron obtenidos como una mezcla de alquenos Z/E en la cual predomina el E-estilbeno deseado. La estequiometría de estos compuestos fue determinada de forma inequívoca a partir de sus datos espectroscópicos y por comparación con el análogo 199, cuya estructura fue determinada mediante el análisis de difracción de rayos X del monocristal. Finalmente, la funcionalización del anillo de piridazinona en estos derivados se llevó a cabo mediante tratamiento ácido y posterior metilación, proporcionando los hidroxi y metoxi derivados 206-217. Una vez sintetizados los diferentes compuestos híbridos, se ha llevado a cabo un estudio de actividad como inhibidores de la agregación plaquetaria, inhibidores de la MAO-B, agentes antineoplásico y, además, se ha llevado a cabo ensayos de desnaturalización térmica del ADN para determinar su posible aplicación como agentes enlazantes al surco menor del ADN. En cuanto a los resultados obtenidos, indican que trece de treinta y cuatro híbridos cumarina-piridazina han mostrado una importante actividad como agente antiplaquetario, con valores de concentración inhibitoria 50 (CI50) menores de 100 µM, lo que sugiere que la combinación de los núcleos de piridazina y cumarina tiene un efecto muy favorable en la inhibición de la agregación plaquetaria. Además, se ha podido observar que la actividad se ve afectada por la sustitución tanto en el anillo de cumarina como en el de piridazina, lo cual nos ha permitido realizar un estudio comparativo de estructura-actividad. Los datos obtenidos también muestran que la actividad de estos compuesntos como antiagregantes plaquetarios es altamente dependiente de la ausencia de sustituyentes en la posición N2 del anillo de piridazina, ya que se observa una gran disminución de la actividad inhibitoria cuando el átomo de hidrógeno es sustituido por un grupo metilo o bencilo. Además, dicha actividad disminuye cuando se lleva a cabo la funcionalización del anillo de piridazina como cloruro o metoxi, obteniendo valores de CI50 mayores de 100 µM. Por otro lado, el efecto inhibitorio de la MAO ha sido determinado en un amplio grupo de híbridos cumarina-piridazina. Los resultados indican que muchos de los compuestos estudiados hasta el momento actúan como inhibidores de la MAO-B con valores de CI50 menores de 100 µM lo que sugiere que la funcionalización del anillo de piridazina es esencial para la mejora de la actividad. Además, estos estudios enzimáticos han revelado que todos los compuestos ensayados resultaron inactivos frente la MAO-A e inhibieron selectivamente la MAO-B, con valores de CI50 en el rango micromolar o sub-micromolar. Se ha podido determinar que la inhibición de la MAO-B por los híbridos de cumarina-piridazina es dependiente de la funcionalización del anillo de piridazinona, ya que esta se ve afectada por el tamaño del sustituyente en la posición N2 del anillo. Sin embargo, una mejora de la actividad se observa cuando se lleva a cabo la funcionalización del anillo de piridazina como halo derivado (bromo o cloro), siendo el compuesto 48 el más activo de la serie (CI50= 0.56 µM). Además, con el fin de determinar el tipo de inhibición, se han llevado a cabo experimentos de reversibilidad para los compuestos 46 y 48, los más activos de la serie. Así, ambos compuestos resultaron ser inhibidores reversibles de la MAO-B, sin embargo, se obtuvieron valores más bajos que los obtenidos para los compuestos de referencia. Por otro lado, con el fin de analizar el modo de unión de estos compuestos a la MAO-B, así como estudiar las interacciones entre los compuestos y la enzima que permitan explicar los resultados experimentales, se llevaron a cabo estudios de docking. Así, a partir de las imágenes obtenidas, se concluye que el anillo de cumarina se posiciona hacia el cofactor FAD mientras que el anillo de piridazina lo hace hacia la entrada hidrofóbica de la cavidad de la MAO-B. Además, se han podido comprobar que el compuesto 48, el más potente de la serie, se encuentra estabilizado en la cavidad mediante enlaces de hidrógeno con el residuo de cistidina 172 y mediante interacciones π-π stacking con el residuo de tirosina 326, lo que podría explicar su alta actividad. Experimentos de citotoxicidad permitieron confirmar que todos los compuestos ensayados no resultaron tóxicos a las concentraciones de trabajo, por lo que a raíz de estos datos, se puede justificar el gran interés farmacológico de este tipo de compuestos. Otros ensayos como la predicción de propiedades fisicoquímicas (absorción, distribución, metabolismo y excreción) y el cálculo de la capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica se llevaron a cabo con el fin de completar el estudio realizado sobre estos derivados cumarínicos. En cuanto a la actividad antineoplásica de los híbridos sintetizados, se han realizado estudios in vitro frente a tres líneas celulares cancerosas humanas: cáncer de ovario (A-2780), cáncer de mama (MCF-7) y cáncer de pulmón (NCI-H460) para los híbridos cumarina-piridazina. Además, los híbridos de guanidina-piridazinona (162-168) han sido ensayados in vitro frente a la línea celular de leucemia (HL-60). Los compuestos 8, 11, 14 y 40 mostraron una moderada o baja actividad citostática en la línea celular A-2780, con valores de CI50 entre 106 – 45 µM, sin embargo, el compuesto 11 resultó ser también activo en las otras dos líneas celulares ensayadas, MCF-7 y NCI-H460 con valores de CI50 de 56 y 51 µM respectivamente. En cuanto a los híbridos de guanidina-piridazinona, todos los compuestos ensayados mostraron una baja actividad, con valores de viabilidad celular comprendidos entre 75 - 90%, por lo que sus valores de concentración inhibitoria no fueron calculados. Para los compuestos 162-175, se llevaron a cabo ensayos de desnaturalización térmica del ADN que permiten determinar su posible aplicación como agentes enlazantes al surco menor de ADN. No se han obtenido variaciones en la Tm cuando los compuestos 162-168 fueron ensayados, lo cual está relacionado con su baja afinidad hacia la unión y probablemente con su estructura, ya que un único grupo guanidínico no es suficiente para llevar a cabo la unión al ADN. Sin embargo, variaciones en la temperatura de desnaturalización con valores comprendidos entre 1.2 y 4 oC se han obtenido para los derivado bisguanidínicos. En este caso, esa variación de temperatura se debe a que la estabilización de la doble hélice por interacciones de van del Waals y enlaces de hidrógeno entre el compuesto y las bases del ADN provoca un aumento de la entalpía y, por lo tanto, es necesaria una mayor energía para producir su desnaturalización. Por lo tanto, estos valores implican que los compuestos 169-175 se comportan como agentes enlazantes al surco menor, siendo el más activo el compuesto 174. Finalmente, con la idea de ampliar el conocimiento sobre el modo de unión entre el compuesto y las bases nitrogenadas del ADN, se llevaron a cabo experimentos de dicroísmo circular. Así, a partir de los datos obtenidos se ha podido confirmar que los compuestos ensayados actúan como agentes enlazantes al surco menor del ADN. Como conclusión, se ha llevado a cabo la síntesis de 77 híbridos cumarina-piridazina cuya actividad in vitro como antiagregantes plaquetarios, inhibidores de la MAO-B y antineoplásicos ha sido determinada. Once híbridos guanidina-piridazinona han sido sintetizados utilizando diferentes metodologías y su actividad antineoplásica ha sido determinada, además, se han llevado a cabo estudios de desnaturalización térmica del ADN que permiten determinar su aplicación como agentes enlazantes al surco menor del ADN. Finalmente, dos estrategias sintéticas han sido empleadas para la obtención de diecinueve híbridos estibeno-piridazinona, cuyo potencial biológico como antiagregantes plaquetarios, inhibidores de la MAO-B y antineoplásicos será determinado.