Inmovilización covalente y orientada de enzima lacasa para su uso como biocátodo en pilas de combustible

Resumen

ÍNDICE 1-. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Biopilas de combustible 3 1.2. Inmovilización de enzimas en superficies 6 1.3. Funcionalización de superficies 9 1.3.1. Superficies metálicas 9 1.3.2. Superficies de carbón 11 1.4. Lacasas 13 1.4.1. Características generales 14 1.4.2. Estructura 14 1.4.3. Centros de cobre 16 1.4.4. Potencial redox del centro T1 17 1.4.5. Propiedades catalíticas 18 1.4.6. Sustratos 20 1.4.7. Inhibidores 21 1.4.8. Transferencia electrónica lacasa-electrodo 22 1.4.9. ABTS como mediador 23 1.4.10. Trametes hirsuta 24 1.5. Cinética enzimática 25 - I - 2-. OBJETIVOS 29 3-. MATERIALES Y MÉTODOS 33 3.1. Materiales 35 3.1.1. Enzima lacasa 35 3.1.2. Reactivos 35 3.1.3. Disoluciones 36 3.1.4. Instrumentación analítica 37 3.1.5. Material electroquímico 38 3.1.5.1. Electrodos 38 3.1.5.1. Celdas electroquímicas 39 3.1.6. Otros aparatos 39 3.2. Métodos 39 3.2.1. Caracterización de las enzimas 39 3.2.1.1. Medida de la concentración de enzima 39 3.2.1.2. Medida de la actividad enzimática 40 3.2.1.3. Cálculo de las constantes cinéticas 41 3.2.2. Pretratamiento de los electrodos 42 3.2.3. Caracterización electroquímica de los electrodos base 42 3.2.3.1. Área electroquímica 43 3.2.3.2. Área microscópica 43 - II - 3.2.4. Distribución del tamaño de poro 45 3.2.5. Funcionalización de los electrodos de oro 46 3.2.6. Funcionalización de los electrodos de carbono 47 3.2.6.1. Monocapa aminofenilos 47 3.2.6.2. Monocapa aminofenoles 47 3.2.7. Inmovilización de enzima lacasa en el electrodo 48 3.2.7.1. Adsorción física 48 3.2.7.2. Inmovilización covalente 48 3.2.8. Medidas electroquímicas 49 3.2.8.1. Electrodos funcionalizados con lacasa 49 3.2.8.2. Biopila de combustible 50 3.2.9. Detección de agua oxigenada 51 4-. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 53 4.1. Caracterización de la lacasa Trametes hirsuta 55 4.1.1. Cálculo de la concentración de enzima 55 4.1.2. Cálculo de la actividad enzimática 56 4.1.3. Cálculo de las constantes cinéticas respecto al O2 57 4.2. Electrodos de carbono 62 4.2.1. Caracterización de los electrodos base 62 - III - 4.2.1.1. Caracterización electroquímica 62 4.2.1.2. Distribución porosa 63 4.2.2. Funcionalización de los electrodos de carbono 66 4.2.2.1. Recubrimiento de las superficies con una monocapa de 4-aminofenilos 66 4.2.2.1.1. Formación de la monocapa 66 4.2.2.1.2. Características de la monocapa de aminofenilos covalentemente unida a las distintas superficies de carbono 68 4.2.2.2. Recubrimiento de las superficies con una monocapa de orto-aminofenoles 69 4.2.2.2.1. Formación de la monocapa 69 4.2.2.2.2. Optimización de la formación 72 4.2.2.2.3. Características de la monocapa de aminofenoles covalentemente unida a las distintas superficies de carbono 76 4.2.3. Medida de la actividad electrocatalítica del enzima Trametes hirsuta 79 4.2.3.1. Efecto del pH 79 4.2.3.2. Efecto de la temperatura 82 4.2.3.3. Efecto del potencial redox 83 - IV - 4.2.4. Optimización de las condiciones de inmovilización de la lacasa mediante enlace amida sobre electrodos de carbono funcionalizados 84 4.2.4.1. Unión covalente a electrodos modificados con una monocapa de aminofenilos/hidroxilaminos 85 4.2.4.1.1. Efecto de la fuerza iónica 85 4.2.4.1.2. Efecto de la cantidad de enzima 86 4.2.4.1.3. Efecto del pH 87 4.2.4.1.4. Estudio simultáneo de la influencia del pH y la cantidad de enzima durante la inmovilización mediante metodología del diseño de experimentos 89 4.2.4.2. Unión covalente a electrodos modificados con una monocapa de aminofenoles 93 4.2.4.2.1. Estudio simultáneo de la influencia del pH y la cantidad de enzima durante la inmovilización mediante metodología del diseño de experimentos 93 4.2.5. Propiedades electrocatalíticas de la lacasa de Trametes hirsuta inmovilizada covalentemente en electrodos de carbono mediante enlace amida 96 4.2.5.1. Experimentos control 96 4.2.5.2. Reducción electroenzimática de O2 con diferentes superficies electródicas 97 4.2.5.3. Orientación de la lacasa en el electrodo 100 4.2.5.4. Sensibilidad 103 - V - 4.2.5.5. Estabilidad 104 4.2.5.6. Inhibición por haluros 106 4.2.5.6.1. Fluoruros 106 4.2.5.6.2. Cloruros 107 4.2.5.7. Efecto de la velocidad de rotación del electrodo 110 4.2.6. Inmovilización de la lacasa Trametes hirsuta a través de sus residuos azúcares superficiales (formación de bases de Schiff) 114 4.2.6.1. Efecto en la actividad enzimática en disolución 114 4.2.6.2. Respuesta electrocatalítica 115 4.2.6.3. Orientación de la lacasa 115 4.2.6.4. Efecto de la rotación 117 4.2.6.5. Inhibición por haluros 120 4.2.6.6. Estabilidad de la señal 120 4.3. Electrodos de oro 123 4.3.1. Electrodos tridimensionales 124 4.3.1.1. Caracterización de los electrodos 124 4.3.1.2. Respuesta electrocatalítica 127 4.3.1.3. Estabilidad 129 4.3.2. Electrodos de disco de oro 130 4.3.3. Nanopartículas de oro 132 - VI - 4.4. Diseño de una biopila de combustible enzimática basada en la transferencia electrónica directa entre enzima y electrodo 136 4.4.1. Bioánodo enzimático 136 4.4.2. Biocátodo enzimático 138 4.4.3. Biopila de combustible 139 5-. CONCLUSIONES 143 5.1. Caracterización de la enzima 145 5.2. Electrodos de carbono 145 5.3. Electrodos de oro 148 5.4. Biopila de combustible 148 6-. BIBLIOGRAFÍA 151