Clonación y estudios de expresión del factor de crecimiento Vasculo-Endotelial (VEGF) en trucha arco iris ("Oncorhynchus mykiss")

Resumo

La mayor parte de los avances en el estudio de la vasculogénesis y la angiogénesis se han realizado en especies de mamíferos, dejando un pequeño papel para otras especies de vertebrados. Así, el único modelo de angiogénesis in vitro desarrollado en un teleósteo, la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), ha permitido avanzar en le estudio de la vasculogénesis en vertebrados inferiores. En el presente trabajo se ha ampliado el abanico de herramientas disponibles para el estuido de estos dos importantes procesos, realizando la clonación del principal regulador de la angiogénesis, el factor de crecimiento vasculo-endotelial (VEGF) de trucha arco iris. Asimismo, se ha realizado la clonación parcial de un fragmento del gen VEGFR-2, que codifica para el receptor principal del VEGF, y del factor derivado de plaquetas (PDGF-A). En el caso del VEGF, se han clonado dos formas moleculares, una de 122 aminoácidos y otra de 166 aminoácidos, producidas pro procesamiento alternativo del ARN mensajero. La proteína VEGF122 fue expresada en Escherichia coli y la proteína recombinante purificada a partir de los cuerpos de inclusión producidos. Para estudiar la actividad biológica de la proteína recombinante se realizaron estudios de expresión génica, mediante la técnica de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), en las líneas celulares angiogénicas TSS y TPS-2 de O.mykiss estimuladas con VEGF122 recombinante. Los genes estudiados incluyeron: interleukina-1B (IL-1B), ciclo-oxigenasa 2(COX2), cadena B del MHC-II (MHC-IIB), y los del propio gen VEGF y de su receptor VEGFR-2. Como controles positivos de la expresión de estos genes en las líneas celulares, estos ensayos se realizaron también en presencia de los agentes estimulantes lipopolisacárido bacteriano (LPS) y el factor de la necrosis tumoral (TNF-a) recombinante de O. mykiss. Estos estudios han permitido concluir que las líneas celulares TS