Incidencia de aflatoxinas en leche de oveja y derivados en Castilla-La Mancha.

Résumé

La producción de leche de oveja es de gran importancia en el área Mediterránea, siendo España la cuarta productora de la Unión Europea (UE) con casi 440.000 toneladas al año. De esta leche, alrededor del 10% se destina a elaborar queso Manchego con Denominación de Origen Protegida (DOP), un producto de calidad que debe garantizar la seguridad del consumidor, para lo cual se han establecido normas específicas no sólo a nivel higiénico-sanitario (Reglamento 853/2004), sino también contemplando la presencia de residuos y contaminantes (Directiva 96/23/CE) como las aflatoxinas (AFs). Estas micotoxinas son un grupo de metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos del género Aspergillus, principalmente por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius. Varias de ellas han sido clasificadas como cancerígenas para los humanos debido a su elevada toxicidad y distribución mundial, siendo la más tóxica la AFB1, seguida de la AFM1, metabolito de la oxidación que es excretado en la leche de los animales que han ingerido alimentos contaminados con la primera. Por los problemas de salud que ocasionan, la UE ha establecido límites tanto para la presencia de AFB1 en alimentos y piensos, como de AFM1 en leche. Sin embargo, no existe regulación oficial para los derivados lácteos como el queso. Para el control del cumplimiento de estos límites, los métodos oficiales de análisis están basados en la cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorimétrica (HPLC-FD), aunque en los últimos años métodos inmunoenzimáticos del tipo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) han sido utilizados con éxito para el muestreo de AFs. La monitorización de AFM1 en leche se realiza en muchos países por el riesgo de exposición de la población, aunque no menos importante es su presencia en los derivados lácteos, ya que esta toxina puede aparecer en cantidades muy elevadas, sobre todo en el queso. En esta línea se incluye el trabajo de la presente tesis doctoral, en la que se ha pretendido cumplir con varios objetivos. El objetivo principal consistió en conocer la incidencia de AFM1 en leche de oveja Manchega y su principal derivado, el queso Manchego DOP; así como en identificar el origen de la contaminación por esta toxina mediante el estudio de la presencia de AFB1 en las raciones de las ovejas cuya leche hubiera sido positiva a AFM1. Para conseguirlo, fue necesario abordar varios objetivos parciales previos, como la adaptación de los métodos ELISA a las distintas matrices a analizar; el estudio de los factores condicionantes de la respuesta tanto de los métodos ELISA como del HPLC; y por último, conocer el nivel de transferencia de la AFM1 en leche de oveja a sus derivados. Tras la realización de un muestreo en la región de Castilla-La Mancha, para tener información acerca de la incidencia de AFM1 en la leche de oveja destinada a elaborar queso Manchego, se pudo observar que el 99,3% de las muestras de leche de tanque y el 99% de las muestras de silo y cuajada, se encontraban por debajo del límite legal establecido por la Unión Europea (50 ng kg-1). Con estos resultados se podría afirmar que la seguridad alimentaria de estos productos está garantizada, mediante el control, respecto a la presencia de AFM1. Sin embargo, al ser tan baja la incidencia de esta toxina no fue posible identificar el origen de la contaminación de la leche en las raciones de las ovejas. Para llegar a obtener estos resultados fue necesario evaluar el funcionamiento de diversos métodos comerciales ELISA en el análisis de AFM1, ya que éstos han sido desarrollados principalmente para la leche de vaca, y se desconocía su funcionamiento en la matriz ovina. Así, se compararon cinco métodos en el análisis de muestras contaminadas artificialmente observándose que no todos obtienen resultados válidos, aunque las recuperaciones medias están comprendidas en los rangos señalados por el Reglamento 401/2006. Posteriormente se seleccionaron los dos métodos (B y D) que mostraron recuperaciones más próximas al 100% y se evaluó la influencia que factores como la presencia de conservantes en la leche, el tipo de conservante (azidiol y bronopol), el uso de la refrigeración o la congelación pudieran tener en la detección de la AFM1. Ni la refrigeración a 4ºC durante 5 días, ni la congelación a -25ºC durante 15 días, interfirieron en la detección de la AFM1. Sin embargo, el uso de conservantes combinado con refrigeración, principalmente bronopol, influyó significativamente (P<0,05), observándose a los 5 días de almacenamiento pérdidas de AFM1 comprendidas entre el 10 y el 20%, dependiendo del método empleado, por lo que se desaconsejó el uso de este conservante en el control rutinario de muestras de leche de oveja con estos métodos. También se estudió el comportamiento de métodos ELISA en el análisis de AFB1 en alimentos típicos de las raciones de ovino lechero de Castilla-La Mancha, como pulpas de cítricos o ensilados, cuya particularidad es su alto contenido en humedad. Este es un aspecto no contemplado por los procedimientos de estos métodos, desarrollados principalmente para la determinación de alimentos más secos. Cuando se realizaron ensayos de repetibilidad utilizando heno de alfalfa, maíz en grano y pulpa de cítricos, los valores de recuperación para el HPLC (84,5-117,3%) fueron comparables a los del ELISA (60,5-129,4%), aunque se concluyó que sería necesario realizar más análisis para que estos métodos pudieran ser validados para el análisis de AFB1 en las matrices seleccionadas. Además, en el análisis de distintos tipos de alimentos, los resultados obtenidos mediante el ELISA, y confirmados a través del HPLC, mostraron bajos niveles de toxina en todas la muestras excepto en el ensilado de maíz, donde se detectó un nivel de AFB1 de 10,1 µg kg-1, que se consideró falso positivo al no detectarse AFB1 con el método oficial. Finalmente, para conocer el nivel de transferencia de la AFM1 de la leche de oveja a sus derivados lácteos, se realizó un estudio mediante la contaminación artificial de la leche a 50 y 100 ng kg-1, elaborándose queso Manchego y requesón con ella. La concentración media de AFM1 en la cuajada y el queso, cuando se analizó con HPLC fue de 2 a 3 veces superior respecto a la leche con la que fueron elaborados, y de 3 y 9 con el ELISA, mientras que en el suero permaneció entre un 42 y un 87% de los niveles iniciales de AFM1. En el requesón, la AFM1 se concentró un máximo de 1,7 veces respecto al suero, y además en el suero de requesón, todavía permaneció la toxina entre un 34 y 44% respecto a la leche inicial. A pesar de estos resultados, según los niveles iniciales en la leche de este estudio, la concentración que podría aparecer en el queso Manchego elaborado, no debería suponer un problema para la salud pública. Además, en el caso de que fuera necesario refrigerar (hasta 2 días) o congelar (hasta 14 días) las muestras de cuajada y requesón, por requerimientos en la planificación del trabajo de laboratorio, estos tratamientos durante períodos cortos de tiempo no afectarían a la recuperación de la AFM1. La realización de estos estudios ha permitido avanzar en el conocimiento de la calidad de la leche y los derivados lácteos respecto a la presencia de AFM1 en un sector, el ovino, muy importante en la región de Castilla-La Mancha, que sufre en la actualidad una evidente crisis. Sin embargo, respecto a los niveles de la toxina en estos productos, la salud de los consumidores está garantizada. Ewe's milk production is of great importance in the Mediterranean area. Spain is the fourth producer of the European Union (EU) with almost 440,000 tons per year. From this milk, around 10% is destined to the manufacture of Manchego cheese under a Protected Designation of Origin (PDO), a product of high quality which must guarantee the consumer's safety. Specific rules have been established not only to accomplish the hygienic-sanitary levels (Regulation 853/2004), but also with respect to the presence of residues and contaminants (Directive 96/23/EC) like aflatoxins (AFs). These mycotoxins are a group of secondary metabolites produced by filamentous fungi from the genera Aspergillus, mainly by A. flavus, A. parasiticus and A. nomius. Due to its high toxicity and worldwide distribution, they have been classified as carcinogenic for humans, being AFB1 more toxic than M1, an oxidized metabolite excreted in milk of lactating animals which have ingested contaminated feeds with AFB1. Because of the health problems they cause, limits for the presence of AFB1 have been established in the EU for foods and feeds, and for AFM1 in milk as well, since they do not exist for dairy products like cheese. The official method for the analysis of AFs is the high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection (HPLC-FD), but in the last years Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (ELISAs) have been used successfully for the analysis of AFs. The AFM1 screening in milk is carried out in a lot of countries because of the exposition risk of the population, although its presence in dairy products is not less important, because this toxin can appear in very high levels, mainly in cheese. The work of this doctoral thesis was conducted on this research line, as it has been pretended to fulfill several objectives. The main one consisted on knowing the incidence of AFM1 in Manchega ewe's milk and its main dairy product, the Manchego cheese PDO. In addition, we aimed to identify the origin of this toxin contamination through the study of the AFB1 presence in ewes' rations whose milk had been positive to AFM1. In order to reach this, it was necessary to establish several different previous partial objectives, like the adaptation of ELISA methods to the different matrixes to analyze; the study of the conditioning factors for the ELISA and HPLC answer; and finally, to know the transference level of AFM1 from ewe's milk to its manufactured products. After the screening in the Castilla-La Mancha region, for getting information about the occurrence of AFM1 in ewe's milk destined to the manufacture of Manchego cheese, it could be observed that the 99.3% of milk samples and the 99% of silo milk and curds, were below the legal limit established by the European Union. With these results it could be stated that using the control the food safety of these products is guaranteed, with respect to the presence of AFM1. However, due to the low incidence of this toxin it was not possible to identify the milk contamination origin in the ewes' rations. It was also necessary to evaluate the behavior of different ELISA commercial methods for the analysis of AFM1, because they have been mainly developed for cow's milk and it is unknown how they work with the ovine matrix. Therefore, five different methods were compared in the analysis of artificially contaminated samples and it was observed that not all of them get valid results, although mean recoveries are into the ranges indicated by the Regulation 401/2006. After this, the two methods which showed mean recoveries near 100% were selected (B and D) and it was also evaluated the influence of factors that could influence the AFM1 detection like the presence of preservatives in milk, the type of preservative (azidiol or bronopol) and the use of refrigeration or freezing. Neither refrigeration at 4ºC for 5 days, nor freezing at -25ºC for 15 days, interfered the detection of AFM1. However, the combined use of preservatives with refrigeration, mainly bronopol, had a significant influence (P<0.05), detecting losses of AFM1 after 5 days of preservation between the 10% and the 20%, depending on the method used. Therefore this preservative should not be used in the routine control of ewe milk samples with these methods. The behavior of ELISA methods have been also studied for the analysis of AFB1 in typical feeds in the rations of dairy ewes in Castilla-La Mancha, like citrus pulps or silages, characterized by a high humidity content. This is an aspect that is not considered by these methods' procedures, developed mainly for drier feeds. For the repeatability assays made with lucerne hay, corn grains and citrus pulp, recovery values with HPLC (84.5-117.35%) were comparable to those of the ELISA method (60.5-129.4%), although it was concluded that it would be necessary to perform more analyses to validate these methods for the analysis of AFB1 in the selected matrixes. Moreover, in the analysis of different feeds types, the results obtained using ELISA, and confirmed by HPLC, showed low toxin levels in all the samples except in the corn silage, where an AFB1 level of 10.1 µg kg-1 was detected, which was considered a false negative because no AFB1 could be detected with the official method. Finally, to know the AFM1 transference level from ewe's milk to its dairy products, a study was performed with the artificial contamination of milk at 50 and 100 ng kg-1, manufacturing Manchego cheese and Requesón with it. The mean AFM1 concentration in curd and cheese, when it was analyzed using HPLC, was from 2 to 3 times higher than the milk they were made of, and 3 to 9 times with the ELISA, while the 42% and the 87% of the initial AFM1 levels stayed at the whey. In the Requesón, AFM1 appeared 1.7 times higher respect the whey and besides the 34% and the 44% already stayed at the Requesón whey. Despite these results, according with the initial levels founded on milk of this study, the concentration that could appear in the manufactured Manchego cheese would not suppose a problem for public health. Moreover, if the refrigeration (up to 2 days) or freezing (up to 14 days) of curd and Requesón samples were needed, due to requirements in the laboratory work plan, these treatments for short periods of time would not affect the AFM1 recovery. The achievement of these studies has allowed advancing in the knowledge of the quality of milk and dairy products for the presence of AFM1 in a sector, the ewe one, very important in the Castilla-La Mancha region, which is currently suffering an obvious crisis. However, with respect to the levels of the toxin in these products, consumer's health is guaranteed.