Role of the ndr kinase cbk1 in the regulation of morphogenesis and transcriptional control in candida albicans / cbk1papel regulador de la ndr quinasa en la morfogénesis y control transcripcional de cándida albicans

Resumen

Las NDR quinasas son componentes esenciales de rutas celulares implicadas en morfogénesis, control de ciclo celular y viabilidad en células eucariotas. En este trabajo se analiza el papel de la NDR quinasa Cbk1en la morfogénesis y el control transcripcional del patógeno humano Candida albicans. C. albicans es un hongo polimórfico capaz de realizar transiciones morfogenésicas reversibles entre tres formas diferentes: levaduras, pseudohifas e hifas, en función de las señales ambientales (Odds, 1985) estando dichos cambios morfogenésicos directamente relacionados con su virulencia (Zheng et al., 2004). En el primer capítulo de este trabajo, titulado ¿Fosforregulación de Mob2 en la morfogénesis de C. albicans¿ se demuestra que la NDR quinasa Cbk1 y su subunidad reguladora Mob2, son fundamentales en la regulación del crecimiento polarizado en C. albicans. Ambas porteínas se localizan en las zonas de crecimiento activo y son necesarias tanto para la iniciación como para el mantenimiento del crecimiento hifal. Mediante electroforesis bidimensional y posterior Western Blot (2D-WB), se puso de manifiesto la existencia de distintas fosfoisoformas de Mob2 dependientes del tipo de crecimiento. El análisis del estado de fosforilación de Mob2 en distintos mutantes, experimentos de actividad quinasa in vitro, co-inmunoprecipitación (CoIP) y mutagénesis dirigida de los sitios consenso de fosforilación por CDKs de Mob2 indican que Mob2 es un sustrato directo de la quinasa dependiente de ciclo Cdc28. El análisis fenotípico de los mutantes fosfodefectivos de Mob2 (mob2-4A) para los cuatro sitios consenso de fosforilación por Cdc28 reflejó que la fosforilación de dichos residuos es necesaria durante el mantenimiento del crecimiento hiperpolarizado y la inhibición de la separación celular en respuesta a suero. Los defectos morfológicos de las hifas de los mutantes mob2-4A se correlacionaron con una desorganización de la estructura del polarisoma, como demuestran los estudios de microscopía de fluorescencia con las proteínas Spa2-GFP y Kel1-GFP. Igualmente, experimentos de RT-PCR mostraron que en las hifas del mutante mob2-4A se produce un incremento en la expresión de los genes diana de Ace2, implicados en la degradación del septo tras la citocinesis. En este mismo capítulo, se proponen a la fosfatasa Cdc14 y la quinasa Kic1 como posibles reguladores adicionales del estado de fosforilación de Mob2. El Segundo capítulo, titulado ¿Papel de la quinasa Cbk1 en la formación de biofilms en C. albicans¿ se centra en el estudio de las funciones de la ruta RAM en el proceso de formación de biofilms. Los biofilms pueden definirse como comunidades de microorganismos asociadas a sustratos vivos o inertes que muestran características diferentes a las de los cultivos planctónicos como la secreción de una matriz extracelular, cooperación metabólica o programas de expresión génica específicos que en su conjunto confieren al hongo importantes ventajas adaptativas como el aumento de la resistencia a antifúngicos y la mayor tasa de supervivencia frente al sistema inmune del hospedador. En este capítulo, realizado en colaboración con el grupo del Dr. d¿Enfert del Instituto Pasteur a través de una estancia breve de 3 meses subvencionada por el programa de becas FPU, se demuestra, mediante técnicas como la inducción de la formación de biofilms en microfermentadores (García-Sánchez et al., 2004), microscopía confocal, 2D-WB, CoIPs, RT-PCR y ChIP, que la NDR quinasa Cbk1 regula la actividad transcripcional de Bcr1, esencial para la formación de biofilms en C. albicans. Nuestros resultados muestran que Bcr1 es una fosfoproteína, cuyo estado de fosforilación depende de Cbk1 y que interacciona in vivo con la NDR quinasa. Bcr1 presenta dos sitios consenso de fosforilación por Cbk1, en la treonina 191 y la serina 556. La mutagénesis dirigida de dichos residuos a alanina (bcr1AA, bcr1T191A y bcr1S556A) generó defectos severos en la adherencia, producción de biomasa y estructura de los biofilms, fenotipo que se correlacionó con un descenso en los niveles de expresión de ALS3, principal diana de Bcr1. La deleción de CBK1 así como la de otros componentes de la ruta RAM, tales como TAO3, KIC1 o MOB2, también dio lugar a graves defectos en el desarrollo de biofilms. Sin embargo, la introducción de la versión fosfomimética de Bcr1 en los residuos T191 y S556 (bcr1EE) en un fondo cbk1¿ incrementó los niveles de expresión de ALS3, rescatando parcialmente la capacidad de formación de biofilms de dicho mutante. De esta forma, nuestros datos relacionan por primera vez las funciones de la ruta RAM con el control transcripcional durante la formación de biofilms en C. albicans a través de la fosforilación de Bcr1 por la NDR quinasa Cbk1.