Caracterización de tres modelos animales de resistencia insulínica

Resumen

La diabetes mellitus es, sin duda, la pandemia de la era moderna. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el mundo hay más de 346 millones de personas con diabetes. Se estima que la prevalencia de diabetes en Europa es 7.8%, afectando a más de 48 millones de adultos en edades entre 20 y 79 años, lo que representa un aumento de la morbi-mortalidad asociada a esta patología al igual que un altísimo costo para el sistema sanitario en lo que respecta a atención médica y al tratamiento de las complicaciones asociadas a la diabetes. El 90% de las personas con diabetes padecen diabetes tipo 2, la cual se desarrolla a través de un proceso en varios pasos. Inicialmente el organismo es incapaz de usar la insulina eficientemente, una condición que se conoce como resistencia insulínica. En este momento, las células ß-pancreáticas tratan de compensar produciendo más insulina. Durante un tiempo, esta compensación ayuda a mantener normoglucemia, pero llega un momento en que la célula beta se queda exhausta y no puede secretar suficiente insulina para compensar la resistencia insulínica. En este punto, esta condición progresa frecuentemente a diabetes. La Resistencia insulínica es un síndrome caracterizado por una disminución en la capacidad de respuesta de los tejidos a la insulina (pérdida de sensibilidad), un defecto en la acción de la insulina que provoca un aumento en la insulina basal para mantener la glucemia en un rango normal. Esta respuesta anómala es una característica propia de diversas patologías, aunque principalmente se encuentra asociada con obesidad y diabetes tipo 2 [1,2]. 2.1.- El ratón mutante para el receptor de la leptina. La mutación autosómica recesiva espontánea en el receptor de la leptina causante de diabetes fue descubierta en el Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, en 1966 en el cepa C57BLKS/J. Comúnmente conocido como db, después de su clonaje recibió el nombre de Leprdb/db. La ausencia del receptor de la leptina (hormona producida en en su mayoría por los adipocitos, aunque también se expresa en el hipotálamo, el ovario y la placenta) produce polifagia en estos animales que se hacen obesos desde temprana edad. Los Lepr db/db son modelos de resistencia insulínica, diabetes tipo 2 y obesidad. Son animales que se han utilizado en las dos últimas décadas para el estudio de estas enfermedades y están validados por la comunidad científica. A pesar de ello, no existen publicaciones de estudios exhaustivos de su fenotipo, por lo cual se hace necesaria una caracterización más detallada si se quieren hacer estudios en momentos críticos de la evolución de la enfermedad [3,4]. 2.2.- El ratón transgénico APP/PS1. La enfermedad de Alzheimer (EA) y la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) son dos enfermedades muy frecuentes en los países desarrollados con aspectos patológicos comparables y con predisposición genética. Varios estudios clínicos y epidemiológicos han mostrado la la relación existente entre EA y DM2. Pacientes con DM2 presentan un incremento en el riesgo de desarrollar demencia y EA. Por un lado, pacientes que sufren EA son más vulnerables a desarrollar DM2. Curiosamente, ambas enfermedades están relacionadas por presentar alteraciones patológicas en cerebro y páncreas. Pacientes con EA muestran numerosos depósitos de péptido ß-amiloide (Aß) en cerebro, mientras que pacientes con DM2 presentan depósitos de polipéptido amiloide en las células ß-pancreáticas. Por otro lado, los pacientes con DM2 son intolerantes a la glucosa y resistentes a la insulina, presentando una disminución en la señalización de insulina en los tejidos periféricos, mientras que pacientes con EA muestran signos de daño en la señalización de la insulina en el cerebro. Estas observaciones nos incitan a pensar que esas alteraciones patológicas pueden indicar una unión mecanística entre DM2 y EA [5,6,7]. Para clarificar la relación existente entre EA y DM2: 1)Investigaremos el fenotipo metabólico del ratón APP/PS1. 2) cruzaremos ratones transgénicos APPswe/PS1dE9 (APP/PS1), un modelo conocido de Alzheimer, con el ratón heterocigoto para el receptor de la leptina (Lepr db/+), un modelo de predisposición genética a DM2 del que ya hablamos previamente, generando ratones Lepr +/+;APP/PS1 y Lepr db/+;APP/PS1. Nuestros resultados proporcionarán nuevos puntos de vista sobre los mecanismos que subyacen a la patofisiología de ambas enfermedades. 2.3.- El ratón mutante para la apolipoproteína D. La Apolipoproteína D (ApoD) es una lipocalina ampliamente expresada en los tejidos de mamíferos cuya función molecular básica y general es la de unir y transportar ligandos hidrofóbicos. In vitro, ApoD une a estos ligandos hidrofóbicos con una elevada afinidad (por ejemplo, pregnolona, progesterona y ácido araquidónico), mientras que se une al colesterol con muy baja afinidad. La expresión de ApoD es predominantemente en el sistema nervioso, particularmente con el envejecimiento o tras un daño inducido. Se ha demostrado ApoD que ejerce un papel protector en dos situaciones: controla los niveles cerebrales de peroxidación de lípidos en un modelo de envejecimiento acelerado por daño oxidativo; y controla el grado y la duración de los procesos inflamatorios después de una lesión del nervio periférico, influyendo así en la velocidad de regeneración de los nervios. ApoD fue descubierta de forma simultánea en humanos en el líquido procedente de quistes de pecho y como una apolipoproteína presente en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y en menor medida, entre las lipoproteínas de baja densidad (VLDL). Se trata de una apolipoproteína atípica, sin relación en estructura y origen evolutivo con otras apolipoproteínas. Debido a que ApoD se encuentran principalmente en las HDL, se propuso que ejercía un papel en homeostasis de los lípidos [8,9]. Estudios epidemiológicos en humanos asocian variaciones genéticas en ApoD con elevados niveles plasmáticos de triglicéridos (TG); así mismo, el polimorfismo de TaqI en los genes de ApoD está asociado con el desarrollo de obesidad, resistencia insulínica, hiperinsulinemia y DM2 [10,11,12]. El papel preciso en mamíferos de ApoD en la regulación del metabolismo lipídico no ha sido estudiado en profundidad, y para un mayor conocimiento del papel de ApoD en el metabolismo de TG se requiere un análisis en un modelo murino de pérdida de función. En este proyecto planteamos la hipótesis de que la pérdida de ApoD incrementa los niveles plasmáticos de TG, lo que contribuiría a la patogénesis de dislipidemia y predispone a la aparición de resistencia insulínica. Por todo ello nos planteamos las siguientes hipótesis de partida: 1) El desarrollo de resistencia insulínica y diabetes en el modelo Lepr db/db se desarrolla en diversas etapas mediado por la plasticidad de las células ß-pancreáticas. 2) La predisposición genética a desarrollar EA puede facilitar la aparición de resistencia insulínica y/o DM2. 3) La pérdida de expresión de ApoD incrementará los niveles plasmáticos de triglicéridos, induciendo dislipidemia y resistencia insulínica. *Para verificar la hipótesis 1: El desarrollo de resistencia insulínica y diabetes en el modelo Lepr db/db se desarrolla en diversas etapas mediado por la plasticidad de las células ß-pancreáticas. Tras amplificar la colonia mediante cruces entre ratones heterocigotos (debido a que la mutación Lepr db/db es una mutación autosómica recesiva que produce la esterilidad de los dobles mutantes), se procederá a su genotipado para la discriminación y selección de los ratones de estudio. Para estudiar los efectos de la pérdida de señalización de leptina en el desarrollo de resistencia insulínica realizaremos la caracterización metabólica de nuestro modelo a lo largo del tiempo. Para ello mediremos peso, niveles de glucosa en plasma, niveles plasmáticos de insulina, triglicéridos y colesterol, emplearemos un test de sobrecarga de glucosa (IPGTT) y un test de tolerancia a la insulina (IPITT). Las medidas fisiológicas se realizaran tanto en ayunas como en postprandial. El IPGTT se realizará en animales en ayunas durante 18 h. Se administrará un bolus oral de glucosa (2 g/kg de peso corporal). Seguidamente, la concentración de glucosa en sangre se monitorizará con un glucómetro a intervalos de 15 minutos durante 2 horas. Para el IPITT, no será necesario ayunar a los animales. Se les administrará insulina (0.75 U/kg peso corporal) mediante una inyección intraperitoneal. La concentración de glucosa en sangre se monitorizará con un glucómetro cada 15 minutos durante una hora. Para dilucidar si el aumento del número de células beta-pancreáticas es el mecanismo que compensa la resistencia insulínica del páncreas en la fases iniciales de la DM2 y si el fallo de este mecanismo lidera la aparición de diabetes franca se realizará un estudio de la masa de células ß pancreáticas mediante inmunohistoquímica. Para ello, los animales serán sacrificados, los páncreas serán diseccionados y pesados, fijados con Bouin¿s y formalina 4%, incluidos en bloques de parafina y cortados en secciones de 5 µm, tras lo cual se realizará la tinción histoquímica con insulina, se fotografiará y se cuantificará la masa de células ß-pancreáticas mediante el programa informático Image J. Para la búsqueda de diferencias de expresión génica y proteica en islotes pancreáticos de estos ratones, se realizarán estudios de expresión génica mediante microarrays de y de expresión proteica mediante Western Blot. Para ello, los animales serán sacrificados, los páncreas serán perfundidos con colagenasa, extirpados y digeridos, y tras varias centrifugaciones y lavados obtendremos los islotes pancreáticos. En el primer caso se extraerá el ARN de dichos islotes, que será hibridado con diferentes sondas en un microarray. En el segundo caso los islotes serán homogenizados con un tampón de extracción de proteínas y las proteínas serán cuantificadas por el método Micro BCA. Los extractos proteicos obtenidos serán utilizados para el estudio mediante Western Blot de proteínas relacionadas con la señalización de insulina (p. ej: pAKT, AKT). *Para verificar la hipótesis 2: La predisposición genética a desarrollar EA puede facilitar la aparición de resistencia insulínica y/o DM2. Para demostrar si la EA puede acelerar el desarrollo del fenotipo diabético estudiaremos si el hecho de sufrir EA predispone al desarrollo de DM2 en individuos con una predisposición genética a la misma. Para ello generaremos la colonia mixta APP/PS1;Lepr db/+ mediante el cruce de ratones portadores de los transgenes APPswe/PS1dE9 con ratones Leprdb/+. Posteriormente se procederá a su genotipado para la discriminación y selección de los ratones de estudio. Para estudiar el efecto de la expresión transgénica de APP/PS1 en el desarrollo de resistencia insulínica en ratones con una predisposición genética a padecer diabetes (ratones Lepr db/+) realizaremos la caracterización metabólica de nuestro modelo a lo largo del tiempo. Para ello mediremos peso, niveles de glucosa en plasma, niveles plasmáticos de insulina, triglicéridos y colesterol, emplearemos un IPGTT, un test de capacidad de secreción insulínica, un test de tolerancia al piruvato y un IPITT. Las medidas fisiológicas se realizaran tanto en ayunas como en postprandial. Para determinar el impacto de la coexpresión de los transgenes APP/PS1 en la masa de células ß-pancreáticas de ratones Lepr db/+ realizaremos un análisis histomorfométrico de la masa de células ß en los ratones APP/PS1;Leprdb/+ y en los ratones control. Para un mayor conocimiento del desarrollo de resistencia insulínica en este modelo, estudiaremos la señalización de insulina en hígado y músculo mediante Western Blot y la gluconeogénesis hepática mediante RT-PCR. Para ello los animales serán ayunados toda la noche, tras lo cual a la mitad de ellos se les inyectará intraperitonealmente una dosis de insulina de 0,75 U/Kg peso del animal y a la otra mitad un volumen similar de suero salino fisiológico. Transcurridos 15 minutos los animales serán sacrificados, les serán extirpados hígado, músculo gastrocnemius y músculo soleus. Los tejidos serán homogenizados con un tampón de extracción de proteínas (Cell Signaling Tecnology, Reino Unido) y las proteínas serán medidas. Los extractos proteicos obtenidos serán utilizados para el estudio mediante Western Blot de los niveles de AKT fosforilada en residuo de serina 473 (p-AKT ser 473) y los niveles de AKT total; y para el estudio de los niveles de ARNm de 2 enzimas responsables de la gluconeogénesis hepática: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) y glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa) mediante RT-PCR. *Para verificar la hipótesis 3: La pérdida de expresión de ApoD incrementará los niveles plasmáticos de triglicéridos, induciendo dislipidemia y resistencia insulínica. La generación parental de esta colonia estará compuesta por camadas Apo D-/- y Apo D+/+ procedentes de cruces heterocigotos para la mutación ApoD en el fondo genético C57BL/6. Esta estrategia evitará los potenciales efectos maternos de Apo D y generará grupos ApoD+/+ y Apo D-/- en un fondo genético homocigótico. Tras la amplificación de la colonia se procederá a su genotipado para la discriminación y selección de los ratones de estudio. Para este estudio se utilizarán machos de la F1 procedentes de cruces homocigóticos. Para investigar el efecto de la deficiencia de ApoD sobre la regulación del metabolismo de la glucosa y de los triglicéridos realizaremos la caracterización metabólica de este modelo a los2 meses y al año. Para ello mediremos peso, ingesta diaria, niveles de glucosa en plasma, niveles plasmáticos de insulina, triglicéridos y colesterol, emplearemos un IPGTT y un IPITT. Las medidas fisiológicas se realizarán tanto en ayunas como en postprandial. Para investigar si la deficiencia de ApoD ejerce un efecto en las células productoras de insulina, realizaremos un análisis histomorfométrico de la masa de células ß tanto en los ratones Apo D-/- como en los ratones control. Para investigar el efecto potencial de la deficiencia de ApoD en el metabolismo lipídico hepático, determinaremos el contenido de TG del hígado y se analizará el contenido lipídico mediante la tinción de Oil-O-Red. Esta técnica se realiza sobre muestras fijadas y criopreservadas, para ello, se sacrificaran los animales, se les extirpará el hígado y se fijará con paraforlmaldehído (PFA), tras los cual se pasará a una solución de 30% de sacarosa. Posteriormente los tejidos serán incluidos en OCT. Los bloques obtenidos se congelarán a -80ºC. y con la ayuda de un criostato se realizarán secciones de 10 µm de grosor sobre la que se realizará una tinción con Oil Red O, tras la cual se realizará una contratinción con hematoxilina. Para determinar el efecto de la deficiencia de ApoD en los niveles de expresión proteicas de Lipoproteín-lipasa (LPL), una enzima clave en la hidrólisis y aclaramiento de las partículas ricas en TG en tejidos periféricos se tomaran muestras de tejido graso del epidídimo de ratones experimentales y de sus controles, éstas serán tratadas con un tampón de extracción al que se le añadirán inhibidores de proteasas, se cuantificará la cantidad de proteína y mediante Western Blot se analizarán los niveles de LPL de las mismas. ASPECTOS ÉTICOS: Al tratarse de un estudio con animales el tamaño muestral se ajustará a la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre Ética de la Experimentación Animal, de modo que se utilicen el menor número de animales posible con el que puedan obtenerse resultados fiables. ESTUDIO ESTADÍSTICO Y NÚMERO DE LA MUESTRA: Para calcular el tamaño muestral de los grupos de animales a emplear, nos hemos basado en datos preliminares obtenidos en experimentos pilotos llevados a cabo para estudios similares, los cuales han sido publicados por la Dra. Cózar-Castellano, directora de la tesis doctoral, según la siguiente bibliografía: (Cózar-Castellano et al. Diabetes 55:70, 2006 y Cózar-Castellano et al. Diabetes 55:3271, 2006). Basándonos en estos estudios, se necesitarán 10 animales por grupo, edad y sexo. Este número de animales por grupo permitirá la detección de diferencias de 1.4 veces en la desviación estándar de la media de los valores entre los grupos de estudio con un 80% de probabilidad (o un 0,8 de poder) con un valor alfa de 0.05. Los datos serán recogidos en hojas de cálculo de Excell donde se le aplicarán los test estadísticos. La distribución de las variables numéricas se evaluará mediante histograma y el test de Kolmogorov-Smirnoff. En caso de tener una distribución normal, las diferencias entre grupos se estudiarán mediante el análisis de la varianza (ANOVA) cuando sean grupos superiores a dos, y el test no pareado de la t de Student si se trata de dos grupos. Se empleará la prueba de Bonferroni como test post-hoc. En caso de variables no paramétricas se empleará la U de Mann-Whitney para comparar grupos de dos, y el test H de Kruskal-Wallis cuando los grupos sean superiores a dos. Del mismo modo se empleará la prueba de Bonferroni como test post-hoc. El nivel de significancia queda previamente establecido en el del 95% (p< 0,5).