Estudio mediante técnicas inmunoquímicas del efecto del procesado en algunas proteínas alergénicas y recombinantes de los alimentos

Laburpena

Las técnicas inmunoquímicas para la detección de proteínas alergénicas y recombinantes son muy usadas actualmente en el control de calidad en la industria alimentaria. Estas técnicas presentan una alta sensibilidad y especificidad, además de ser sencillas, rápidas y de bajo coste. Sin embargo, hay que considerar que, cuando estas técnicas van a ser aplicadas en el análisis de alimentos procesados, los tratamientos tecnológicos aplicados pueden alterar la solubilidad de la proteína diana, dificultando su extracción o desnaturalizarla, destruyendo epítopos que son reconocidos por sus anticuerpos específicos. En esta tesis, se ha estudiado el efecto que los tratamientos tecnológicos, fundamentalmente los térmicos, tienen sobre la determinación de las proteínas alergénicas, concretamente la ß-lactoglobulina de la leche y el ovomucoide del huevo, y sobre la determinación de la proteína recombinante Cry1A(b) del maíz transgénico. Estos estudios son esenciales para controlar la fiabilidad de los sistemas de detección basados en técnicas inmunoquímicas. Además, se ha estudiado el efecto de la pepsina en la degradación de la proteína Cry1A(b), estudio que es importante para evaluar su potencial alergenicidad. Para llevar a cabo el trabajo, se desarrollaron técnicas inmunoenzimáticas de ELISA (tipo competitivo indirecto y tipo sándwich), y una técnica de inmunocromatografía para la determinación de las proteínas ß-lactoglobulina bovina, ovomucoide y Cry1A(b). Los estudios de termorresistencia se llevaron a cabo calentando las proteínas en tubos capilares a diferentes temperaturas, y determinando la cantidad de proteína inmunorreactiva utilizando las técnicas de ELISA desarrolladas. En el caso de la proteína Cry1A(b), se calcularon también los parámetros cinéticos y termodinámicos de su desnaturalización. Los resultados obtenidos con las proteínas alergénicas, ß-lactoglobulina y ovomucoide, indican que ambas mantienen, tras ser sometidas a tratamientos térmicos intensos, una reactividad residual con los anticuerpos obtenidos frente a ellos, lo que permite detectarlas desnaturalizadas utilizando técnicas inmunoquímicas. Sin embargo, la proteína Cry1A(b) presenta una alta sensibilidad frente a los tratamientos térmicos, de forma que pierde la inmunorreactividad con sus anticuerpos específicos durante el calentamiento, lo que hace que no pueda ser detectada tras tratamientos térmicos de moderada intensidad. Con el objeto de estudiar el efecto que tienen distintos tipos de procesado de los alimentos sobre la desnaturalización de las proteínas estudiadas, se elaboraron alimentos modelo en una planta piloto utilizando como ingredientes leche y huevo en polvo, o maíz transgénico, y se determinó la cantidad de proteína inmunorreactiva utilizando las técnicas inmunoquímicas desarrolladas. Las técnicas de ELISA desarrolladas para la detección de ß-lactoglobulina bovina y ovomucoide fueron objeto de un estudio colaborativo para evaluar y comparar los dos formatos de ELISA, utilizando los alimentos modelo. Los resultados obtenidos con ambos formatos de ELISA indicaron que los tratamientos tecnológicos aplicados durante el procesado de los alimentos modelo que contienen como ingredientes leche y huevo disminuyen la cantidad de ß-lactoglobulina y ovomucoide inmunorreactivos, siendo la disminución mayor cuanto mayor es la intensidad del tratamiento aplicado. Por ello, la cantidad de leche o huevo que ha de ser añadido para dar un resultado positivo por las técnicas de ELISA es menor en el producto pasterizado (salchicha), seguida del horneado (pan) y del esterilizado (paté). De las dos técnicas de ELISA desarrolladas para la determinación de ß-lactoglobulina, el formato de tipo sándwich resultó, por su mayor sensibilidad y especificidad, más adecuado que el de tipo competitivo indirecto para detectar la presencia de leche en alimentos procesados. En el caso del ovomucoide, el formato de tipo competitivo indirecto resultó más adecuado para detectar la presencia de huevo en alimentos procesados que el de tipo sándwich, ya que sólo utilizando este formato se pudo detectar el ovomucoide en las muestras de paté. En este trabajo se han analizado también diversos alimentos comerciales utilizando los dos formatos de ELISA para comprobar que se cumple la legislación vigente de etiquetado de alérgenos. El 14% de las muestras de alimentos comerciales analizados en este trabajo contenía proteínas lácteas sin declarar en la etiqueta. Sin embargo, no se detectó la presencia de huevo en ninguno de los alimentos comerciales analizados cuya etiqueta no incluía como ingredientes huevo o sus derivados. Por otra parte, no se detectó la presencia de leche o huevo en un 13% y un 33%, respectivamente, de los alimentos comerciales en los que la presencia de dichos ingredientes estaba indicada en la etiqueta, lo que supone una restricción en la gama de productos para el consumidor alérgico. Los resultados obtenidos con la proteína Cry1A(b) indicaron que se desnaturaliza rápidamente por los tratamientos tecnológicos que habitualmente se utilizan en la industria alimentaria, resultando en un marcado descenso en la concentración de proteína inmunorreactiva. Así, el alto grado de desnaturalización sufrido por la proteína Cry1A(b) durante la elaboración de productos tales como las farinetas, las tortillas fritas o a la plancha, no permitiría su detección en los productos finales cuando se usan técnicas inmunoquímicas. Por ello, el etiquetado de alimentos que contienen maíz transgénico debería realizarse en base a los resultados obtenidos en el análisis de los ingredientes utilizados para su elaboración, y con el seguimiento de los mismos mediante un adecuado sistema de trazabilidad. Por otra parte, la técnica de inmunocromatografía desarrollada para la detección de proteínas alergénicas, ß-lactoglobulina y ovomucoide, y de la proteína Cry1A(b), ha presentado en todos los casos una sensibilidad ligeramente inferior a las técnicas de ELISA. Sin embargo, sus características de sencillez y rapidez hacen que sea la técnica de elección para ser usada como home test o para el control in situ de la contaminación en la industria alimentaria. De los resultados obtenidos en este trabajo se deriva que la detección de proteínas en alimentos procesados utilizando técnicas inmunoquímicas depende de las propiedades de la proteína diana, sobre todo de su termorresistencia, de la población de anticuerpos utilizada, de las características intrínsecas de la técnica usada y de la intensidad del tratamiento térmico al que ha sido sometido el alimento durante su elaboración. Por otra parte, en el estudio del efecto que tiene la incubación con pepsina sobre la proteína, nuestro estudio se ha centrado únicamente en la utilización de este enzima, debido a que la proteína que se expresa en el maíz MON810 es la forma activa de la toxina, que es el núcleo de ésta resistente a la tripsina. Para llevar a cabo este estudio, fue necesario aislar previamente la proteína Cry1A(b) expresada en el maíz transgénico. El aislamiento se realizó a partir de un extracto de hojas utilizando una columna que contenía anticuerpos anti-proteína Cry1A(b) insolubilizados en Sepharose. Los resultados obtenidos en el análisis de la proteína purificada por la técnica de identificación de proteínas por huella peptídica usando espectrometría de masas (MALDI-TOF), y los obtenidos al determinar la reactividad cruzada, indicaron un alto grado de homología con la proteína Cry1A(b) de B. thuringiensis. En el estudio de proteolisis, se observó que la proteína Cry1A(b) se degrada en 30 minutos por acción de la pepsina porcina, dando lugar mayoritariamente a péptidos de entre 6 y 8 kDa, que se mantienen tras 4 horas de incubación. La proteína hidrolizada mantiene alrededor de un 27% de su inmunorreactividad al analizarla por la técnica de ELISA, lo que indica que los péptidos formados contienen algunos epítopos que son reconocidos por los anticuerpos usados en el ensayo. El conjunto de los resultados obtenidos en el estudio de la proteína Cry1A(b) aislada de maíz transgénico indican que es una proteína muy sensible al tratamiento térmico y a la degradación con pepsina, propiedades que no son compartidas por la mayoría de las proteínas alergénicas conocidas de alimentos.