Caracterización bioquímica y morfológica de la retina y nervio óptico del ratón que sobreexpresa el gen tp53. Implicaciones en la etiopatogenia de enfermedades oculares mediadas por procesos de apoptosis y angiogénesis

Resumen

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE), el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) y la retinopatía diabética proliferante (RDP) son enfermedades oftalmológicas de elevada prevalencia, que se relacionan etiopatogénicamente con procesos de angiogénesis y/o apoptosis en la retina. Sin embargo, se desconocen las bases celulares y moleculares que promueven el inicio o la progresión de estas enfermedades. Se necesitan estudios experimentales y ensayos controlados adicionales que permitan identificar a los pacientes con mayor riesgo de posibles complicaciones y de la pérdida de visión. La proteína p53 tiene un peso molecular de 53 kD (de ahí su nombre) y su principal característica es que interveniene directamente en el control del ciclo celular y en la replicación y reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN), manteniendo la estabilidad genómica, activando la apoptosis y participando en la respuesta celular a agentes externos nocivos. La proteína p53 es fundamentamente un regulador de la expresión génica, actuando como factor de transcripción capaz de activar o de inhibir genes específicos, entre los que destacan el gen p21, los genes bax y fas, el gen IGF-BP3 (insulin-like growth factor-binding protein-3), el gen gadd45 (growth arrest and DNA damage-45) y el gen de la ciclina G, todos ellos implicados en el ciclo de división celular y por ende en los procesos de proliferación y apoptosis. Y ya que el aumento de la actividad oxidativa es capaz de inactivar la proteína p53 y que dicha proteína podría ser un marcador biológico del estrés oxidativo endocelular, regulando al mismo tiempo los procesos de inducción o inhibición de la apoptosis o de la angiogénesis (o de ambos) en situaciones propicias, pretendemos caracterizar morfológica, y molecularmente lar retina y nervio óptico en un modelo experimental en el ratón, teniendo como base la presencia del gen p53. En esta Tesis Doctoral planteamos el estudio de las propiedades de la proteína p53, para intentar comprender su función en las enfermedades oculares neurodegenerativas, que por su morbilidad son causa principal de minusvalías y de ceguera en todo el mundo. Para ello hemos utilizado un modelo experimental en el ratón, que se ha manipulado genéticamente para poseer copias supernumerarias del gen p53 en forma de largos transgenes, lo que ha permitido obtener ratones con una o dos copias extras, los super p53. Utilizando un modelo de ratón transgénico Charles River C57BL6/J generado por el grupo del Dr. Manuel Serrano (CNIO, Madrid) mediante adición de 1 ó de 2 copias extras del gen p53 (sp53-1 y sp53-2), hemos realizado los estudios y los hemos comparado con los datos obtenidos de ratones silvestres de genoma normal. Los globos oculares y nervios ópticos, se han obtenido y procesado para: 1) técnicas de examen morfológico y morfométrico a microscopía óptica, 2) técnicas de inmunohistoquímica en montaje plano de la retina, mediante anticuerpo frente a la proteína fibrilar ácida de la glia e identificación y cuantificación de astrocitos, 3) western blot e immunoblotting, mediante anticuerpos frente a los enzimas de la cascada apoptótica poli adenil ribosa polimerasa 1 (PARP1) y caspasa 3 (CS3), 4) determinación mediante ELISA del Oxido Nítrico, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y 5) determinación enzimático-colorimétrica de la actividad oxidativa (malonildialdehído) y antioxidante total. Los resultados demuestran que las retinas y nervios ópticos de los ratones sp53 presentan variaciones estructurales y morfométricas significativas respecto a los ratones normales. Los astrocitos eran mas numerosos y se distribuían de forma diferente en la retina de los sp53 que en la de los controles. Las bandas de expresión de PARP1 y CS3 fueron más notables en las retinas de sp53 que en CG, confirmando mediante cuantificación láser (unidades densitométricas relativas) el aumento significativo de las moléculas implicadas en supervivencia y muerte celular en ratones sp53 frente a controles (p<0,001). Además observamos aumento significativo de la síntesis de ON, y un aumento muy considerable de la actividad antioxidante en la retina y nervio óptico de los sp53 con respecto a los controles. Estos resultados demuestran que la presencia de una copia extra del gen p53 confiere unas características celulares y moleculares diferentes a los tejidos oculares estudiados, que las observadas en los animales con genoma normal. Todos los datos sugieren que la actividad dual p53 contribuye a regular la supervivencia y muerte celular en la retina, y en particular los procesos de angiogénesis y apoptosis, apoyando esta característica para comprender la patogenia de la DMAE, GPAA y RDP, y las nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas que se deriven de este hallazgo, lo que permitiría delimitar la importancia de este gen en la respuesta farmacológica y modificarla en razón de la misma.