Nuevas estrategias metodológicas y de análisis de datos de citrometría de flujo aplicadas al diagnóstico y clasificación de las hemopatías malignas

Resum

Tesis doctoral realizada por compendio de publicaciones. Así, se incluyen dos trabajos (extensos) originales publicados en revistas científicas indexadas en el Science Citation Reports. Dichas publicaciones son el resultado del desarrollo de un proyecto multicéntrico financiado por la Unión Europea dentro de VI Programa Marco (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708), que contó con la participación de 8 centros de laboratorios de investigación clínica y diagnóstico, de centros académicos o asistenciales de un número idéntico de países europeos distintos y dos PYMES (empresas de tamaño pequeño/mediano) biotecnológicas del mismo ámbito. Aun cuando los resultados generados se han publicado de forma conjunta en dos artículos, cada uno de ellos esta a su vez conformado por un compendio de artículos, organizados en secciones, cada una de las cuales puede ser considerada por sí sola como una publicación individual debido a su contenido, fase experimental, resultados, impacto y la extensión que ocupa. A continuación se detallan las secciones incluidas por cada uno de los dos trabajos incorporados en la memoria: 1. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Kalina T(1), Flores-Montero J(2), van der Velden VHJ(3), Martin-Ayuso M(4), Böttcher S(5), Ritgen M(5), Almeida J(2), Lhermitte L(6), Asnafi V(6), Mendonça A(7), de Tute R(8), Cullen M(8), Sedek L(9), Vidriales MB(10), Pérez JJ(10), te Marvelde JG(3), Mejstrikova E(1), Hrusak O(1), Szczepanski T(9), van Dongen JJM(3), Orfao A(2) on behalf of the EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). K.T. and F-M.J. have contributed equally to this work Leukemia (2012) 26, 1986–2010; doi:10.1038/leu.2012.122 Se incluyen todas las secciones del artículo 2. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. van Dongen JJM(3), Lhermitte L(6), Böttcher S(5), Almeida J(2), van der Velden VHJ(3), Flores-Montero J(2), Rawstron A(8), Asnafi V(6), Lécrevisse Q(2), Lucio P(7), Mejstrikova E(1), Szczepanski T(9), Kalina T(1), de Tute R(8), Brüggemann M(5), Sedek L(9), Cullen M(8), Langerak AW(3), Mendonça A(7), Macintyre E(6), Martin-Ayuso M(4), Hrusak O(1), Vidriales MB(10), Orfao A(2) on behalf of the EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708) Leukemia (2012) 26, 1908–1975; doi:10.1038/leu.2012.120 Se incluyen las siguientes secciones: Sección 2ª. Lymphoid screening tube (LST) Flores-Montero J(2), Almeida J(2), Pérez JJ(10), Asnafi V(6), Lhermitte L(6), Vidriales MB(10), Böttcher S(5), Mendonça A(7), Lucio P(7), Tielemans D(3), Langerak AW(3), Lima M(11), Santos AH(11), de Tute R(8), Cullen M(8), Rawstron A(8), te Marvelde JG(3), Wind H(3), van der Velden VHJ(3), Sedek L(9), Szczepanski T(9), Kalina T(1), Lécrevisse Q(2), Hernández J(4), van Dongen JJM(3), Orfao A(2) Sección 4ª. Plasma cell disorders (PCD) panel Flores-Montero J(2), Almeida J(2), Pérez JJ(10), Mendonça A(7), Lucio P(7), de Tute R(8), Cullen M(8), Rawstron A(8), Mejstrikova E(1), Sedek L(9), Szczepanski L(9), Lhermitte L(6), van der Velden VHJ(3), Wind H(3), Böttcher S(5), Vidriales MB(10), Kalina T(1), San Miguel J(10), Orfao A(2) Sección 9ª. Antibody panel for T-cell chronic lymphoproliferative diseases (T-CLPD) Almeida J(2), Flores-Montero J(2), Pérez JJ(10), Vidriales MB(10), Lima M(11), Santos AH(12), Langerak AW(3), Tielemans D(3), Lhermitte D(6), Asnafi V(6), Macintyre E(6), Böttcher S(5), Mendonça A(7), Lucio P(7), de Tute R(8), Cullen M(8), Rawstron A(8), Sedek L(9), Szczepanski T(9), Kalina T(1), Martin-Ayuso M(4), van Dongen JJM(3), Orfao A(2) Sección 10ª. Antibody panel for NK-cell chronic lymphoproliferative diseases (NK-CLPD) Almeida J(2), Flores-Montero J(2), Lhermitte L(6), Asnafi V(6), de Tute R(8), Cullen M(8), Rawstron A(8), Tielemans D(3), Langerak AW(3), Pérez JJ(10), Lima(11), Santos AH(11), Mendonça A(7), Lucio P(7), Böttcher S(8), Sedek L(9), Szczepanski T(9), Kalina T(1), Muñoz M(4), van Dongen JJM(3), Orfao A(2) ---------------------------------------------------------------------------------------------- (1)Department of Pediatric Hematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University (DPH/O), Prague, Czech Republic; (2)Cancer Research Center (IBMCC-CSIC), Department of Medicine and Cytometry Service, University of Salamanca (USAL) and Institute of Biomedical Research of Salamanca (IBSAL), Salamanca, Spain; (3)Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands; (4)Cytognos SL, Salamanca, Spain; (5)Second Department of Medicine, University Hospital of Schleswig Holstein, Campus Kiel (UNIKIEL), Kiel, Germany; (6)Department of Hematology, Hôpital Necker and UMR CNRS 8147, University of Paris Descartes (AP-HP), Paris, France; (7)Department of Hematology, Portuguese Institute of Oncology (IPOLFG), Lisbon, Portugal; (8)Haematological Malignancy Diagnostic Service (HMDS), University of Leeds (UNIVLEEDS), Leeds, UK; (9)Department of Pediatric Hematology and Oncology, Medical University of Silesia (SUM), Zabrze, Poland; (10)Department of Hematology, University Hospital Salamanca (HUS) and IBSAL, Salamanca; (11)Department of Hematology, Hospital de Santo António (HSA), Centro Hospitalar do Porto (CHP), Porto, Portugal Los estudios inmunofenotípicos mediante CMF se han convertido en uno de los pilares del diagnóstico y clasificación de las hemopatías malignas. Sin embargo, existe una importante heterogeneidad en las técnicas, paneles y estrategias empleadas en distintos laboratorios para el inmunofenotipado de leucemias y linfomas, asociado a un importante grado de subjetividad en el análisis e interpretación de los resultados. La falta de estandarización, junto con el componente interpretativo subjetivo, hacen que existan importantes niveles de variabilidad en los resultados obtenidos en diferentes centros e incluso en diferentes momentos, en un mismo centro. Todo ello, unido a los importantes desarrollos tecnológicos ocurridos en las últimas décadas que ha incrementado de forma significativa la cantidad de información disponible sobre cada muestra tanto en lo que se refiere al número de parámetros analizados en cada combinación de anticuerpos o panel de combinaciones de anticuerpos, como al número de células analizadas han incrementado aún más la complejidad de todo el proceso. Por otra parte, el número de fluorocromos con los que podemos conjugar cada anticuerpo, ha crecido también de forma muy significativa, generando un número casi ilimitado de posibilidades de combinaciones de estos con los marcadores reconocidos como útiles para el diagnóstico y clasificación de las hemopatías malignas. Como consecuencia de todo lo anteriormente expuesto, actualmente en prácticamente cada laboratorio de diagnóstico se utiliza un panel de anticuerpos distinto, con niveles variables de conocimiento de los perfiles fenotípicos normales de referencia para cada panel, además de la variabilidad asociada a la muestra, las técnicas empleadas para y su procesamiento y el tipo de equipo empleado para realizar las mediciones. Esta mayor complejidad y variabilidad han incrementado notablemente a su vez, la necesidad de formación de expertos con un elevado nivel de conocimientos sobre las características clínicas de la enfermedad, la biología de las células tumorales y su contrapartida normal, además de los aspectos técnicos y metodológicos relacionados con el inmunofenotipado por citometría de flujo. Este problema se agrava aún más si cabe, si tenemos en cuenta que, pese al incremento exponencial de la cantidad de información generada, en paralelo no se han desarrollado las herramientas informáticas necesarias para un análisis e interpretación completa, rápida, sencilla y adecuada de los datos generados. La única forma de atajar el problema de manera eficiente y disminuir de modo significativo los niveles de variabilidad existentes en los resultados obtenidos en este campo, reside en encontrar soluciones innovadoras a los problemas y retos planteados y la definición (y evaluación) de estrategias, paneles de reactivos y protocolos optimizados o estandarizados; en dos palabras, la solución estaría en introducir innovación y estandarización en el inmunofenotipado de las hemopatías malignas mediante CMF para disminuir la variabilidad y subjetividad de todo el proceso, desde las etapas pre-analíticas al informe de los resultados. De hecho, este ha sido en los últimos 10 años, el objetivo del trabajo realizado por el grupo EuroFlow, contexto en el que se encuadra la presente tesis doctoral al asumir el doctorando la responsabilidad de los desarrollos a realizar en aspectos de estandarización técnica en general, y en el rastreo diagnóstico de SLPC (incluidas las NCPs) y la clasificación de los SLPC T y NK, en particular. Por ello, planteamos como objetivo de este trabajo doctoral desarrollar, evaluar e implementar nuevas estrategias y herramientas para la estandarización de las técnicas de inmunofenotipo de hemopatías malignas por citometría de flujo, enfocadas de forma específica al rastreo diagnóstico de SLPC y NCPs y la clasificación de los SLPC T y NK. Para lograr este objetivo, planteamos cuatro objetivos específicos: