Mecanismos de regulación de la replicación en respuesta a estrés replicativo en Saccharomyces Cerevisiae

Resumen

El checkpoint de fase S es un mecanismo de vigilancia que asegura la correcta replicación del DNA durante la fase de síntesis contribuyendo, por tanto, a mantener la estabilidad del genoma. Consiste en una vía de transducción de señales muy conservada a lo largo de la evolución, y cuyas proteínas centrales son las kinasas Mec1 y Rad53 en Saccharomyces cerevisiae (ATR y Chk2 en células de mamíferos o Rad3 y Cds1 en Schizosaccharomyces pombe respectivamente). En condiciones que perturban la replicación, como la presencia de agentes genotóxicos o estrés replicativo, el checkpoint de fase S se activa y desencadena una respuesta que actúa coordinando la replicación, la reparación y la progresión del ciclo celular. Trabajos realizados en la levadura de gemación han demostrado que la función más crítica del checkpoint durante estrés replicativo es preservar la integridad de las horquillas de replicación, siendo esto esencial para mantener la viabilidad celular en dichas condiciones. Nuestro grupo está interesado en el estudio del mecanismo por el que el checkpoint replicativo mantiene horquillas de replicación estables. Sabemos que la degradación de horquillas de replicación observada en un fondo defectivo para el checkpoint está ligada a la presencia de la nucleasa Exo1, aunque los detalles de esa dependencia eran desconocidos. Hemos estudiado el mecanismo de regulación de Exo1 y nuestros resultados indican que Exo1 se fosforila específicamente durante la fase S en condiciones de daño en el DNA o estrés replicativo, y hemos comprobado que dicha fosforilación es dependiente de Rad53. Hemos identificado sitios de fosforilación de Exo1 dependientes de Rad53, tanto por aproximaciones in vitro como in vivo y hemos generado anticuerpos fosfoespecíficos para varios residuos. Además, hemos generado mutantes de fosforilación, cuyo fenotipo indica que la fosforilación de Exo1 es necesaria para evitar el colapso de las horquillas de replicación del mutante rad53. Además parece que la fosforilación de Exo1 regula tanto la actividad catalítica de la proteína como la interacción con las proteínas 14.3.3, proteínas scaffolds implicadas en la transduccion de señales. Sin embargo, se sabe que a pesar de que la estabilización de las horquillas de replicación es imprescindible, no es suficiente para que un mutante rad53 consiga terminar de replicar su genoma en condiciones de estrés replicativo. Este hecho indica que otro papel de Rad53, distinto al de la estabilización de horquillas, es responsable de regular la capacidad de reiniciar horquillas de replicación bloqueadas. En concreto, hemos analizado la contribución de la respuesta transcripcional en este proceso. Nuestros resultados indican que la inducción de la respuesta transcripcional, y en concreto la expresión de ciertas subunidades de la RNR, es clave para permitir el reinicio de las horquillas y completar la replicación tras estrés replicativo.