NADPH oxidasas como diana terapéutica en leucemia meloide crónica (CML)

Zusammenfassung

[ES]El objetivo general de este trabajo fue analizar el potencial de la familia NADPH oxidasa como diana terapéutica en leucemia mieloide crónica. Para desarrollar nuestro estudio utilizamos dos líneas celulares distintas de LMC, denominadas K562 y Boff210. Además utilizamos células mononucleadas (CMNs) de médula ósea de pacientes en fase crónica de la enfermedad y recién diagnosticados, de las cuales seleccionamos también las células hematopoyéticas progenitoras CD34+. La metodología requerida para llevar a cabo la investigación englobó diversas técnicas Bioquímicas y de Biología Molecular, tales como ensayos de proliferación por MTT, ensayos de formación y contaje de colonias, citometría de flujo, transferencia de western, RT-qPCR, ARN de interferencia, etc. Los resultados fueron los siguientes: todos los inhibidores de NADPH oxidasa utilizados (DPI, Apocinina e inhibidor de RAC1) fueron capaces de reducir significativamente la proliferación de las células K562, Boff210 y de las células monucleadas y CD34+ de médula ósea de pacientes, y la combinación de estos inhibidores con Imatinib o Nilotinib mostraba un efecto significativamente mayor, sugiriendo que la actividad NADPH oxidasas es necesaria para el crecimiento de estas células leucémicas. Al analizar la relación entre los agentes, el índice de combinación obtenido en la gran mayoría de los casos indicaba una fuerte sinergia entre ellos, es decir, la inhibición de las NADPH oxidasas era capaz de potenciar el efecto del Imatinib o del Nilotinib (fármacos actualmente utilizados como tratamiento de la Leucemia Mieloide Crónica en los pacientes). Se confirmó también el efecto antiproliferativo de la inhibición de NADPH oxidasas in vivo, utilizando dos modelos animales de LMC diferentes: un modelo de ratón xenoinjerto, en el que se generó un tumor sólido mediante la inoculación de células K562, y un modelo de ratón transgénico p210BCR-ABL, de manera que el DPI (inhibidor de NADPH oxidasas), fue capaz de reducir significativamente el crecimiento del tumor sólido en el modelo xenoinjerto, y de reducir el porcentaje de granulocitos presentes en sangre periférica en los ratones transgénicos, siendo superior el efecto antiproliferativo del tratamiento combinado DPI + Imatinib en ambos casos. Los niveles de ROS disminuían significativamente al tratar las células con DPI ó Imatinib, pero la reducción era significativamente mayor con el doble tratamiento, indicando que los efectos de los tratamientos sobre proliferación están directamente relacionados con una disminución de los niveles de ROS en las células. La activación de las rutas de señalización en K562 dependía de las especies reactivas del oxígeno generadas por las NADPH oxidasas, ya que cuando se inhibían estas enzimas, individualmente o en combinación con el inhibidor de BCR-ABL, los niveles de fosforilación de las proteínas estudiadas (BCR-ABL, CRKL, ERK y STAT5) se veían áltamente disminuidos. Además, el tratamiento con DPI y con la combinación DPI + Imatinib provocaba un fuerte bloqueo del ciclo celular en la fase de mitosis, lo que explicaría, junto con la disminución de la activación de la señalización, los efectos de los tratamientos observados en proliferación. Los estudios de viabilidad reflejaban como la inhibición de las NADPH oxidasas en K562 provocaba una reducción en el porcentaje de células vivas, y la entrada de la células en apoptosis. Cuando la tyr-fosfatasa SHP1 fue silenciada mediante RNAi, los niveles de fosforilación de BCR-ABL se veían incrementados, y cuando se trataron las células leucémicas con DPI o su combinación con Imatinib, la actividad fosfatásica específica de SHP1 aumentó también significativamente. Esto sugiere que la producción de ROS por las NADPH oxidasas mantiene activas las rutas de señalización dirigidas por BCR-ABL mediante la oxidación, y por tanto inhibición, de SHP1, que sería, una de las fosfatasas encargadas de desfosforilar, y por tanto inactivar a BCR-ABL. El estudio por RT-qPCR nos permitió determinar el patrón de expresión de NADPH oxidasas en las células K562 y en CMNs de 4 pacientes diferentes. En ningún caso se expresaron las isoformas NOX1, NOX3 y NOX4. En las células K562, las isoformas presentes fueron NOX2, NOX5 y DUOX2, siendo NOX2 la isoforma predominante. Así, silenciamos estos complejos enzimáticos mediante RNA de interferencia (RNAi) utilizando un sistema de infección lentiviral, y comprobamos como la inhibición de cualquiera de ellos conllevaba una disminución significativa tanto de la proliferación, como de la activación de la señalización, siendo el efecto mayor cuando se producía el silenciamiento simultáneo de las 3 isoformas. Esto sugería una función conjunta de todas las isoformas expresadas en estas células leucémicas, y señalaba como mejor estrategia en la terapia de la Leucemia Mieloide Crónica la utilización de inhibidores globales de NADPH oxidasas frente a inhibidores específicos de una única isoforma. Por tanto, nuestros resultados muestran que el uso de inhibidores específicos para la familia NADPH oxidasa, tanto de manera independiente, como en combinación con inhibidores de la oncoquinasa BCR-ABL, es una estrategia terapéutica efectiva y novedosa para combatir la leucemia mieloide crónica que podría mejorar en el futuro los resultados que se consiguen en los pacientes con la terapia tradicional.