Estudio del metabolismo del óxido nítrico (NO) en Botrytis cinereamecanismos de producción y efectos fisiológicos

Resumen

[ES]Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que infecta a más de 200 especies de plantas y es considerado un organismo necrótrofo ¿modelo¿ que crece preferentemente en tejido muerto o senescente pero que también puede infectar a los tejidos sanos de la planta. Las enormes pérdidas económicas que causa a nivel mundial y su relevancia científica le han dado la categoría de segundo hongo fitopatógeno más importante dentro de la patología molecular de plantas. Durante la interacción planta-patógeno la planta huésped produce peróxido de hidrógeno (H2O2) y óxido nítrico (NO), moléculas muy reactivas con importantes funciones señalizadoras que activan la muerte celular programada y que producen la respuesta de hipersensibilidad (HR). Esta respuesta determina el confinamiento del patógeno al punto de infección inicial, permitiendo a la planta combatir el ataque del patógeno y evitar su progreso a los tejidos circundantes. Además de su papel en la respuesta de hipersensibilidad, el H2O2 y el NO son altamente tóxicos para los microorganismos y las condiciones hostiles que generan impiden el avance de los mismos en la planta huésped. Estos mecanismos resultan efectivos frente a patógenos biótrofos, que necesitan tejidos vegetales vivos para su supervivencia. Evidencias experimentales recientes indican que B. cinerea, como patógeno necrótrofo, se beneficia de esta muerte celular programada y es capaz de sobrevivir en estas condiciones de estrés oxidativo y nitrosativo utilizando mecanismos de detoxificación tanto de las formas activas de oxígeno como de las formas activas de nitrógeno que le permiten infectar y colonizar de manera más efectiva a sus hospedadores. Adicionalmente se ha observado que B. cinerea produce NO, y las evidencias obtenidas sugieren que éste puede contribuir a acentuar la HR de la planta, lo que le conferiría una ventaja añadida a la hora de infectar y colonizar los tejidos adyacentes. B. cinerea posee un eficiente sistema de detoxificación de NO basado en la enzima flavohemoglobina BCFHG1. Se ha comprobado que dicha enzima no constituye un factor esencial en la capacidad del hongo para infectar a la planta y que su función parece más bien estar relacionada con la modulación de los niveles de NO endógeno producido por el hongo durante el crecimiento saprofítico. El hecho de que B. cinerea produzca NO por sí mismo, conlleva importantes interrogantes de gran interés teórico. Dos de las cuestiones más importantes en este contexto son, primera, la relacionada con la naturaleza del mecanismo por medio del cual B. cinerea produce NO y, segunda, aquella que plantea cuáles son las funciones fisiológicas en las que participa el NO en este hongo fitopatógeno. Ambas cuestiones son los temas de investigación principales planteados en la presente tesis doctoral. En bacterias, animales, plantas e incluso en otros hongos filamentosos, existen sistemas enzimáticos como la nitrato reductasa (NR) o la óxido nítrico sintasa (NOS) responsables de la producción de NO. Mediante un análisis bioinformático detallado ha sido posible descartar la presencia de un gen codificador de una enzima tipo NOS convencional en el genoma de B. cinerea. Sin embargo, sí se ha identificado un gen de estas características en el genoma del hongo hemibiotrofo C. graminicola. En B. cinerea, las evidencias previas de tipo bioquímico indicaban que ni el sistema enzimático de la NR, ni el sistema enzimático dependiente de una enzima NOS constituyen los sistemas mayoritarios responsables de la producción de NO en este sistema. La aproximación genética propuesta en este trabajo, basada en la utilización de mutantes deficientes en etapas clave de una y otra ruta, no ha permitido generar información adicional a este respecto. En C. graminicola los intentos para generar un mutante nulo en el gen codificador de una enzima de tipo NOS convencional, y que ha supuesto el análisis de más de 200 transformantes obtenidos con un plásmido diseñado para determinar el reemplazamiento del alelo silvestre del gen identificado, han resultado infructuosos, lo que interpretamos que es consecuencia bien de la baja eficiencia de integración homóloga en este organismo, en particular de la ocurrencia de un doble evento de recombinación homóloga en regiones próximas, bien del carácter esencial de este gen. En ambos organismos la exposición a donadores de NO exógeno determinó un retraso en la germinación. Por su parte, la eliminación de NO endógeno mediante tratamiento con secuestradores de NO, produjo el efecto contrario, es decir, una aceleración en la germinación de las esporas. Además, en el caso de B. cinerea, la exposición a NO de la cepa mutante ¿Bcfhg1, incapaz de detoxificar NO, determinó no un retraso, sino un bloqueo en la germinación. Tomados en conjunto estos resultados sugieren que la modulación de los niveles de NO a los que el microorganismo resulta expuesto afecta a la germinación y, por lo tanto, que el NO juega un importante papel en desarrollo y morfogénesis en ambos sistemas. Con estas observaciones nos planteamos un análisis de expresión génica global en B. cinerea tanto en la cepa silvestre como en la cepa mutante ¿Bcfhg1, en respuesta a donadores de NO y a secuestradores de NO endógeno. Ha resultado particularmente informativo el estudio de la información generada con la cepa mutante ¿Bcfhg1. El análisis transcriptómico llevado a cabo permitió identificar grupos de genes que responden a NO de forma muy intensa. Entre los genes cuya expresión se ve reprimida por exposición a NO en la cepa mutante desprovista de su sistema de detoxificación de NO destacan genes relacionados con procesos de ciclo celular, síntesis de ADN y actividad del nucléolo. Estos resultados, considerados conjuntamente con nuestras observaciones sobre el bloqueo en germinación que determina la exposición a NO en la cepa mutante ¿Bcfhg1, nos lleva a considerar que existe una relación entre exposición a NO exógeno y regulación de ciclo celular en B. cinerea. Las evidencias obtenidas sugieren en particular que la exposición a NO en esta cepa mutante inhibe la síntesis de ADN. Esta inhibición explica el bloqueo observado en división nuclear y germinación. Este bloqueo en la síntesis de ADN y en la división nuclear no parece ser dependiente de la actividad de cdk1, a pesar de que la expresión del gen cdc25, codificador de la fosfatasa de cuya actividad depende la activación y, por lo tanto, la funcionalidad de cdk1, resulta también reprimida por la exposición a NO exógeno en la cepa mutante Por su parte, el análisis de las listas de genes reprimidos por exposición a NO en los experimentos llevados a cabo con la cepa ¿Bcfhg1 demuestran que está enriquecida la categoría funcional ¿regulación de la utilización de nitrógeno¿. Es interesante destacar que entre los genes que muestran un mayor nivel de inducción se encuentran genes codificadores de factores transcripcionales que regulan de forma negativa la expresión de genes de metabolismo del nitrógeno. El análisis transcriptómico llevado a cabo con la cepa silvestre de B. cinerea determinó la identificación de un número de genes que responden a NO mucho menor que en el caso de la cepa ¿Bcfhg1. Además, los genes que responden a NO lo hacen con niveles de inducción o represión más bajos. Todo ello supone que la enzima flavohemoglobina ejerce un papel protector frente a estrés nitrosativo muy notable y que limita de forma importante su efecto sobre expresión génica. Ni entre los genes que se inducen ni entre los genes que se reprimen se detecta enriquecimiento funcional. No obstante del estudio de los listados de genes obtenidos se derivan consideraciones importantes. Entre los genes inducidos en respuesta a NO se encuentra una proporción elevada de genes codificadores de factores de transcripción. Uno de ellos, el gen BoFuT4_P053120.1, denominado en el curso de este estudio BcNor2, que codifica un factor de transcripción tipo Zn(II)/Cys6, fue seleccionado para su análisis funcional. Esta caracterización funcional demostró que BcNor2 participa en la respuesta de B. cinerea al estrés oxidativo mediado por el radical superóxido, al estrés salino mediado por NaCl y al estrés osmótico mediado por Sorbitol. Además, el mutante ¿BcNor2 manifiesta una reducción en su capacidad de crecimiento saprofítico en relación con la cepa Control 1 y exhibe una reducción en su agresividad en plantas de judía. Por otra parte, dentro de los genes reprimidos por NO en la cepa silvestre fue posible identificar una fracción importante de genes relacionados con procesos de desarrollo y diferenciación en eucariotas. Entre ellos destacamos el gen BoFuT4_P059630.1, denominado en el curso de este estudio Bcmd1, codificador de una proteína de función desconocida que aparece asociada al término GO ¿mycelium development¿. Este gen fue seleccionado para llevar a cabo su análisis funcional. En dicho análisis, curiosamente, las cepas mutantes ¿Bcmd1 presentaron el mismo fenotipo que las cepas mutantes, ¿BcNor2, es decir, una menor capacidad de crecimiento saprofítico, una disminución de su capacidad de infectar a la planta huésped y una mayor sensibilidad a estrés oxidativo mediado por menadiona, a estrés salino y a estrés osmótico. Teniendo en cuenta estas observaciones es tentador proponer que ambos genes son importantes en relación con la capacidad de crecimiento y desarrollo del hongo y que Bcmd1, relacionado con desarrollo, pueda estar bajo el control del factor de transcripción BcNor2. Como aproximación experimental complementaria dentro de este trabajo de tesis doctoral, se planteó el estudio de los efectos fenotípicos que pudieran derivarse de la sobreexpresión del gen Bcfhg1. Con este objeto se construyó el plásmido pBcfhg1OV, portador de una fusión génica que permite la expresión del gen codificador de la enzima flavohemoglobina bajo el control del promotor del gen BcActA, construcción que fue introducida en B. cinerea mediante transformación. Se han seleccionado varios transformantes derivados de distintos tipos de procesos de recombinación sobre los que llevar a cabo un análisis de expresión y de función, en particular en relación con alteraciones en germinación, que permita valorar las consecuencias derivadas de una mayor tasa de eliminación de NO endógeno en B. cinerea. Lamentablemente, en el marco temporal de este trabajo sólo fue posible progresar en esta aproximación hasta la fase de selección de transformantes. Nuestro grupo de investigación trabajará en un futuro inmediato en la caracterización detallada de los mismos. En nuestro intento por descubrir el mecanismo de producción de NO y las funciones fisiológicas que éste puede tener en hongos filamentosos en general y en B. cinerea y C. graminicola, en particular, se han llevado a cabo diversas estrategias de carácter farmacológico y genómico que, hasta el momento, apuntan a un efecto regulador del NO en la germinación de ambos microorganismos. El análisis transcriptómico aplicado en B. cinerea ha proporcionado información sobre los procesos y los factores genéticos que median la respuesta a NO en este hongo fitopatógeno necrotrofo.