Caracterización de la función del Rho-GEF Rgf1 en el núcleo de la levadura Schizosaccharomyces pombe

Resumen

[ES]Las GTPasas de la familia Rho son interruptores moleculares que controlan algunos de los procesos clave en biología celular, incluyendo la morfogénesis, el transporte vesicular, la división celular o la motilidad. Los GEFs (guanine nucleotide exchange factors) son los responsables de la activación de las GTPasas de la familia Rho en respuesta distintos estímulos. Modifican el estado de unión a nucleótido de la GTPasa y contienen dominios de interacción entre proteínas que pueden influenciar la localización, la activación, y la estabilización de la GTPasa especificando la unión a sus efectores y por consiguiente su función. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe hay 8 proteínas que pertenecen a la familia Rho-GEF. Uno de estos factores GEF es la proteína Rgf1p que regula específicamente a la GTPasa Rho1p durante el crecimiento polarizado.Como una primera aproximación para analizar la regulación de Rgf1p, hemos estudiado la localización y fenotipo de versiones mutadas de la proteína Rgf1-GFP. Mediante el estudio de estos mutantes comprobamos en primer lugar que el mecanismo por el cual Rgf1p se localiza en los polos de la célula es diferente en ambos polos. Además concluimos que el extremo C-terminal de la proteína Rgf1p que comprende el dominio PH y el CNH, es esencial para la función de la proteína, tanto en la integridad celular como en la polaridad y también participa en la localización de Rgf1p en el polo nuevo, mientras que el extremo N¿-terminal de Rgf1p tiene una función reguladora y es necesario para que la proteína se concentre en los polos de la célula. Además de estos resultados, sorprendentemente, encontramos mutantes en el dominio DEP (Dishevelled, Egl-10, and Pleckstrin) que se localizaban en el núcleo y hemos visto que este dominio se encuentra al lado de una Secuencia de Localización Nuclear (NLS) canónica. Después de probar diferentes condiciones de estrés, descubrimos que la proteína silvestre Rgf1-GFP se localiza en el núcleo en células tratadas con hidroxiurea (HU), una droga que inhibe la actividad de la enzima ribonucleótido reductasa, disminuyendo así el pull de dNTPs en la célula, lo que tiene como consecuencia el bloqueo de las horquillas de replicación y la activación de una respuesta de checkpoint. Encontramos que la localización nuclear de Rgf1p está mediada por la NLS presente en su región N¿-terminal mientras que la salida del núcleo requiere dos Secuencias de Exporte Nuclear (NES) presentes en el extremo C¿-terminal de Rgf1p. Además descubrimos que la acumulación de Rgf1p en el núcleo depende de la proteína 14-3-3 Rad24p y de Cds1p, la quinasa efectora del checkpoint de replicación del DNA y comprobamos que ambas proteínas promueven esta acumulación de Rgf1p mediante la inhibición de su salida del núcleo. Asimismo vimos que las células del mutante rgf1¿ son sensibles a HU en un ensayo en placa pero sobreviven tras un tratamiento agudo con la droga. Estudiamos la progresión del ciclo celular del mutante rgf1¿ tanto en presencia crónica de HU como en la recuperación tras una parada transitoria de la replicación y encontramos en ambos casos que el mutante es competente en la activación del checkpoint y que las células rgf1¿ presentan un retraso en la re-entrada al ciclo celular a diferencia de las células de la cepa silvestre. Siguiendo la formación de focos de Rad22p, una proteína esencial para reparar las roturas en el DNA por recombinación homóloga, comprobamos que el mutante rgf1¿ presenta más lesiones en el DNA que la cepa silvestre tanto en presencia como en ausencia de HU y que estas roturas persisten más tiempo después de un bloqueo de la replicación. En conclusión, nuestros resultados apuntan a que el estrés replicativo causado por HU desencadena una acumulación de Rgf1p en el núcleo, mediada por Rad24p y de Cds1p, dónde la proteína cumple una función por el momento desconocida. La ausencia de esta nueva función de Rgf1p, tiene como consecuencia el aumento de lesiones en el DNA, cuya presencia provoca un retraso en la re-entrada al ciclo celular tras el bloqueo de la replicación. Además hemos encontrado que Rgf1 se localiza en el SPB y su ausencia provoca defectos en el proceso de segregación cromosómica, posiblemente relacionados con la interacción cinetocoro-microtúbulo, que acti­van el Spindle Assembly Checkpoint.