Aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen Tbtri5 de Trichoderma brevicompactum

Résumé

[ES] Trichoderma brevicompactum es un hongo anamórfico descrito recientemente por Kraus y col. (2004) y, por tanto, es poco conocido. Sin embargo, dentro de las actividades biológicas descritas para esta especie destaca la antibiosis. En cuanto a la producción de metabolitos secundarios con actividad biológica en el clade Brevicompactum, se han descrito los trichotecenos como el harzianum A o la trichodermina. Estos trichotecenos se producen en la ruta biosintética de los terpeneos y su biosíntesis está regulada por factores genéticos y ambientales a nivel transcripcional. Se ha descrito que uno de los pasos críticos es la ciclación e isomerización de farnesil pirofosfato (FPP) a trichodieno (TDN), paso catalizado por la trichodieno sintasa, codificada por el gen tri5. A pesar que se han descrito genes similares de la ruta biosintética en Fusarium graminearum, es muy poco lo que se conoce de los genes de esta ruta en T. brevicompactum. La tesis doctoral está enfocada al aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen Tbtri5 en T. brevicompactum IBT40841. Se aisló el gen tri5 utilizando sondas obtenidas a partir de Fusarium, para hibridar con una genoteca de DNA genómico de T. brevicompactum. Posteriormente, se obtuvieron transformantes sobreexpresando el gen Tbtri5. Se realizó el análisis funcional de Tbtri5 tanto en la cepa silvestre IBT40841, como en tres transformantes seleccionados por su actividad antibiótica. Por Southern se determinó una única copia endógena de Tbtri5 y una sola inserción del cassette de expresión en los transformantes. Bajo diferentes condiciones de cultivo y mediante estudios de Real Time PCR, se determinó una mayor expresión del gen en presencia de glucosa, glicerol y H2O2 y una represión en presencia de agentes antioxidantes como ácido ferúlico o tirosol. A partir de extractos acetónicos de cultivos de la cepa silvestre (IBT40841) y de uno de los transformantes; se purificaron por HPLC tres metabolitos: trichodermina, tirosol e hidroxitirosol, siendo éstos mayormente producidos por el transformante. En ensayos de actividad antimicrobiana (CLSI), se demostró que la trichodermina es el metabolito con capacidad antibiótica. La trichodermina fue capaz de inhibir el crecimiento de patógenos de importancia clínica como Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, P. aeruginosa, S. aureus MRSA, E. faecalis vancomicina resistente y A. baumannii. Además, se determinó que la trichodermina posee actividad antitumoral (mecanismo citostático) frente a adenocarcinoma de mama (MCF-7), carcinoma de pulmón (A-549) y carcinoma hepatocelular (Hep-3B y Hep-G2). Los resultados de los ensayos antitumorales indican que la trichodermina tiene menor actividad antitumoral, pero, a su vez, menor citotoxicidad frente a la línea hepatocelular humana sana que el taxol (paclitaxel), un antitumoral utilizado en el tratamiento de tumores sólidos. Por tanto, los resultados indican una relación del gen Tbtri5 de T. brevicompactum con las actividades anteriormente descritas. Por otro lado, análisis de tamaños y secuencias de productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de T. brevicompactum IBT40841 y de T. arundinaceum IBT40837 correspondientes a genes y regiones intergénicas del cluster tri, indican que la disposición de los genes es coincidente en ambas especies del género Trichoderma pero difiere con la descrita para el cluster tri en especies del género Fusarium. Además, a diferencia de lo que ocurre en Fusarium, en las dos cepas de Trichoderma el gen Tbtri5 está situado fuera del cluster tri. Finalmente, la aplicación biotecnológica de T. brevicompactum podría residir en la explotación de las capacidades antimicrobiana y antitumorales de la trichodermina. Precisamente, a diferencia de otras especies del género Trichoderma, éstas capacidades invalidan a T. brevicompactum como agente de control biológico.