Función de la proteína ORC4P en la iniciación de la replicación y en el control transcripcional en Schizosaccharomyces pombe

Resumen

El complejo de reconocimiento del origen (ORC) juega un importante papel en la iniciación de la replicación del DNA en eucariotas. En Schizosaccharomyces pombe, la unión de este complejo a los orígenes de replicación in vitro e in vivo viene mediado por el extremo N-terminal de la subunidad Orc4p. Este dominio contiene 9 motivos de unión al DNA denominados AT-hooks que son capaces de unirse a zonas ricas en adenina y timina sin requerimientos específicos de secuencia. Para analizar en detalle las propiedades que permiten que Orc4p se una al DNA, hemos generado unas cepas en las que el gen orc4+ endógeno ha sido sustituido por una versión modificada con sólo 3, 4, 5 ó 7 AT-hooks, pero que conserva el dominio C-terminal necesario para el correcto ensamblaje del complejo ORC. El análisis por electroforesis bidimensional en geles de agarosa de varios orígenes de replicación en estas cepas muestra que su eficiencia de activación se ve disminuida por la presencia de una proteína Orc4 mutante, probablemente como consecuencia de la menor afinidad por el DNA que presentan los Orc4 mutantes tal y como hemos comprobado por ensayos de inmunoprecipitación de cromatina. Además de estar implicado en la iniciación de la replicación, el complejo ORC interviene en la represión transcripcional de regiones genómicas en varios organismos. Para averiguar si este era el caso de S. pombe comparamos el patrón de expresión genómico del silvestre con el de las cepas mutantes de Orc4. De esta manera, comprobamos que en las cepas mutantes se producía una sobreexpresión de genes adyacentes a orígenes de replicación y de las regiones heterocromáticas. Estos resultados sugieren un papel del complejo ORC en la regulación transcripcional de algunas regiones de la levadura de fisión.