Analysis of autophagy in lung cancer

Resumo

Nuestra hipótesis del trabajo es que la autofagia juega un papel esencial en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de pulmón. Modular la autofagia y la expresión de sus mRNAs y proteínas es una diana terapéutica potencial en esta enfermedad. Nuestro estudio ha evaluado los factores genéticos que afectan autofagia y la expresión de sus proteínas. Además, hemos realizado un análisis bioinformático de los cambios en la expresión de isoformas en las vías de autofagia y apoptosis que pueden afectar las enfermedades del pulmón. Finalmente, hemos estudiado el efecto de tratamientos diferentes que afectan la vía de autofagia. El genotipado se realizó para cuatro polimorfismos de genes relacionados con la autofagia. Los polimorfismos son ATG2B (rs3759601), ATG10 (rs1864183), ATG5 (rs2245214) y ATG16L1 (rs2241880). El análisis de estos polimorfismos se realizó en una muestra de 165 fumadores con cáncer de pulmón y 145 fumadores sanos. El 30% de la muestra tenía EPOC y el 44% tenía una historia de un cáncer en la familia. Nuestros resultados han revelado que el alelo G del gen ATG16L1 (rs2241880) tiene un papel protector frente al desarrollo del cáncer del pulmón, en particular en pacientes sin EPOC. El alelo G del gen ATG16L1 (rs2241880) produce una disminución de la autofagia debido a un aumento de la degradación de ATG16L1 por Caspasa-3 y una interacción reducida con moléculas del dominio WWD necesarias para la función de ATG16L1. Los polimorfismos que hemos estudiado están en la zona codificante del gen, excepto el de ATG5 (rs2245214) que está en un intrón. Nuestro estudio ha investigado la región 5’ no-codificante (5’UTR) para mutaciones que afectan la expresión proteica de genes relacionados con autofagia. Hemos encontrado que la presencia de secuencias “AUG” en la zona promotora (uAUG) tiene un efecto supresor sobre la expresión proteica. En el gen ATG16L2, la distancia entre uAUG y el codón de inicio está relacionado con el efecto inhibidor, efecto que se incrementa al aumentar el número de uAUG. El “dogma central” clásico de biología teoriza “un gen- una proteína”. Aunque después del proyecto del genoma humano se ha descubierto que la mayor parte de eucariotas pueden producir múltiples mRNAs de un gen por un proceso de splicing alternativo. Los mRNAs que resultan se llaman isoformas, y pueden tener la misma función biológica o una función diferente. Los niveles de isoformas cambian con el consumo de tabaco y enfermedades como el cáncer y EPOC. La secuenciación masiva (NGS) es muy útil en los estudios del RNA. Para los biólogos, usar de NGS no es fácil y cuesta mucho su análisis bioinformático. Los resultados se agrupan en tablas de miles de millones de números que no sirven de mucho en el laboratorio molecular. Así, hemos seleccionado los datos para analizar las vías de autofagia y apoptosis de 87 archivos de RNA-Seq de tejido pulmonar de sujeto sanos y pacientes de EPOC y de tumores del pulmón no-microcíticos (ENA/EBI). El análisis se realizó por TopHat/Cufflinks y la plataforma usegalaxy.org. Se utilizaron textos de programación de R3.2.1 para analizar la expresión de genes e isoformas. Hemos encontrado que la vía de la autofagia en el cáncer del pulmón está sobreexpresada (ULK1, ATG13, ATG16L1, Beclin1, P62/SQSTM, ATG7, ATG4B, ATG9A y ATG2A). El inhibidor mTOR presenta niveles altos de expresión total, lo que no es consistente con una autofagia activa. En el cáncer del pulmón, mTOR tiene niveles normales de mTOR canónico (MTOR-001), pero sobreexpresa una isoforma corta (MTOR-002) que puede tener un efecto inhibidor sobre el mTOR canónico, así que la autofagia aumenta. Hemos encontrado una expresión baja de MTOR-002 y de genes de autofagia en EPOC, así como cambios de isoformas en apoptosis han ocurrido en Caspasa-10 (cáncer de pulmón) y Caspasa-3 (EPOC). Nuestros resultados sugieren un posible papel de las isoformas en las enfermedades. Estos cambios en las isoformas pueden servir como biomarcadores en biopsias liquidas o como dianas terapéuticas. Nuestro estudio incluye tres tratamientos que modifican la autofagia. La cloroquina que bloquea los últimos pasos de autofagia; el Panobinostat (LBH589) que inhibe histona deacetilasas (HADCi) y aumenta la autofagia y, finalmente, la metformina que activa la vía del AMPK y aumenta la autofagia. Hemos usado dos líneas-celulares de cáncer de pulmón (H1299 y COR-L23p). El estudio ha utilizado técnicas para medir el crecimiento celular (MTT), las fases del ciclo celular y la muerte (FACS), la morfología de las células y la distribución de las proteínas (microscopía confocal, 3D cultivos y inmunofluorescencia) y estudio de cambios en proteínas relacionadas con autofagia por Western-blot (mTOR, P62/SQSTM1, LC3B y Beclin1) . Nuestros resultados indican que las células que tienen niveles iniciales altos de autofagia (COR-L23p) mueren cuando se tratan con HDACi y eso puede ser por la toxicidad autofagica. Por otro lado, la cloroquina mata a las células con autofagia normal (H1299) y el HDACi baja el nivel del crecimiento celular, pero no produce muerte. La metformina no produzca muerte, pero baja el crecimiento celular con concentraciones altas de fármaco. Las combinaciones diferentes de los fármacos no han producido ganancia en el efecto terapéutico. La vía de la autofagia tiene potencial para ser una diana de fármacos anti-tumorales tan importante como la vía del apoptosis. Sin embargo, se necesitan más estudios de combinaciones posibles de fármacos relacionados con autofagia y más información sobre interacciones entracelulares de proteínas y RNAs.