Estudio y caracterización funcional de efectores implicados en la interacción Colletotrichum graminicola-maíz

Zusammenfassung

Colletotrichum graminicola es el agente causal de la antracnosis del maíz, una de las enfermedades más devastadoras a nivel mundial que sufre este cultivo de enorme interés agroalimentario. Este hongo ascomiceto es un patógeno que desarrolla un estilo de vida hemibiotrofo. Su ciclo de infección comienza colonizando tejidos vivos de la planta y estableciendo una asociación en la cual forma hifas biotróficas. Posteriormente, estas hifas cambian a un estilo de vida necrotrófico, caracterizado por el colapso de la célula huésped y la aparición de los síntomas de la antracnosis. Durante todo este proceso de infección, el hongo secreta cientos de proteínas efectoras que se encargan de modular o suprimir las respuestas defensivas del huésped. La producción y liberación de estos efectores (que pueden localizarse en el espacio intercelular o en el interior de la célula vegetal) se encuentra muy regulada, ya que es necesario que lleven a cabo su función en el lugar y en el momento adecuado. El objetivo de esta Tesis consistió en caracterizar funcionalmente dos proteasas y una proteína pequeña específica de C. graminicola, las cuales fueron seleccionadas como presumibles efectores putativos, en base a la información obtenida en análisis previos realizados por nuestro grupo de investigación. En primer lugar se llevó a cabo el estudio y caracterización de una metaloproteasa fungalisina (Cgfl) de la familia M36. Se obtuvo un árbol filogenético que indicaba que esta fungalisina se encuentra muy conservada entre los hongos de la clase Sordariomicetes. Por otra parte, también se identificó que a lo largo de la evolución se han producido eventos de pérdida y duplicación de este gen. De manera interesante, la mayoría de las perdidas génicas se han dado en especies de hongos saprófitos como Neurospora o Chaetomium, lo que sugiere la posibilidad de que esta proteasa sea un requisito necesario, entre otros muchos, para adquirir la capacidad de infectar plantas. Mediante experimentos de PCR a tiempo real se analizó el patrón de expresión génica durante el proceso de infección y se observó que este gen se expresa de manera evidente a las 36 hpi y alcanza su máximo durante las 60 hpi, durante la etapa biotrófica de la infección. Estos resultados se corroboraron mediante la visualización con microscopía confocal de una cepa de C. graminicola que contenía una construcción de fusión entre la región promotora del gen Cgfl y la proteína verde fluorescente (gfp). Para determinar el posible papel de Cgfl como efector durante el proceso de infección, se obtuvieron mutantes delecionados en el gen y los resultados tanto en hoja como en raíz, mostraron una reducción significativa en la virulencia de estos mutantes con respecto a la cepa silvestre M1.001. Además, se llevaron a cabo estudios de actividad endoproteolítica in vitro con los mutantes de Cgfl, los cuales mostraron una menor actividad proteolítica respecto a la cepa silvestre M1.001. Adicionalmente, se realizó un estudio de actividad quitinasa in planta utilizando un sustrato artificial para quitinasas. De esta forma, se observó que las muestras de plantas inoculadas con el mutante de Cgfl mostraron una actividad quitinasa mayor que aquellas muestras de plantas inoculadas con la cepa silvestre M1.001. En conjunto, estos resultados sugieren que Cgfl es una metaloproteasa fungalisina implicada en la degradación de quitinasas de planta, como ya se había observado anteriormente en otros hongos fitopatógenos. Por último, se descubrió que el genoma del C. graminicola codifica para dos efectores homólogos de Ecp6, un efector presente en otros hongos fitopatógenos e implicado en alterar la inmunidad mediada por quitina. Además, se demostró que estos homólogos son funcionales y se expresan durante la etapa biotrófica de la infección. En el segundo capítulo se analiza la implicación de una subtilisina (CPLS) de C. graminicola como posible efector durante la infección en la planta. Esta subtilisina es una serín-proteasa de la familia S8A, la cual fue identificada en un trabajo previo de nuestro grupo de investigación, como un gen candidato que sufrió un evento de transferencia horizontal desde las plantas hacia un ancestro del género Colletotrichum. Los análisis filogenéticos demostraron que únicamente se encuentran homólogos de CPLS en los géneros Colletotrichum y Diaporthe, con lo cual es posible que el evento de transferencia horizontal se diera en un ancestro común de ambos géneros. Mediante PCR a tiempo real y estudios de microscopía confocal se observó que el gen CPLS se expresaba durante la etapa biotrófica de la infección, con un máximo a las 48 hpi. Los transformantes delecionados en el gen CPLS y mostraron un aumento en el tamaño de lesión con respecto a la capa silvestre M1.001. Además, estos transformantes presentaron una cantidad reducida de biomasa en hoja de maíz, lo cual indica que la proteína CPLS contribuye a la acumulación de biomasa durante el crecimiento del hongo. Por otra parte, no se detectaron diferencias durante la infección en raíz entre los transformantes ΔCPLS y la cepa silvestre M1.001, lo cual indica que este efector es específico de tejido y actúa únicamente durante la infección en las hojas. Para intentar determinar si el gen CPLS se encuentra relacionado con los procesos de muerte celular programada (PCD) en la planta, realizamos análisis mediante PCR a tiempo real de dos genes de maíz codificantes de proteínas receptoras inmunes tipo CC-NLR, implicadas en PCD y respuesta hipersensible (HR). Los resultados mostraron que estos dos genes se encuentran suprimidos durante las primeras etapas de la infección con la cepa silvestre M1.001, e inducidos durante las 24 hpi y las 96 hpi de la infección con los transformantes ΔCPLS. De este modo, es posible pensar que la CPLS estaría implicada en la supresión de los procesos de PCD en la planta, favoreciendo con ello una colonización controlada sobre el huésped. Por último, se analizó y caracterizó funcionalmente la proteína CgEP3 de C. graminicola. Esta proteína consta de un dominio N-terminal que contiene un péptido señal, el cual solapa con una región que muestra semejanza a los dominios N-terminal de las nucleósido fosforilasas (NP), pero carece de la longitud completa del dominio NP encontrado en las proteínas de otros hongos. La región C-terminal no muestra similitud con ningún dominio funcional conocido, pero si tiene similitud con alguna región de proteínas con dominios NP. Este hecho indica que los dos dominios están sujetos a presiones evolutivas asimétricas. El dominio NP, con una función mas conservada, refleja menos acumulación de cambios, mientras que el dominio C-terminal se encuentra menos conservado y evolucionó más rápidamente. El árbol filogenético con la región N-terminal mostró que CgEP3 se agrupa con los homólogos de otras especies de Colletotrichum, Verticillium y Fusarium, encontrando además otras proteínas que, como CgEP3, muestran solapamiento de su péptido señal con la región N-terminal del dominio NP. Además, la filogenia mostró que se han producido varios eventos de duplicación y pérdida a lo largo de la evolución de esta familia de genes. Todo ello indica que CgEP3 desciende de un subfamilia de proteínas secretadas NP, perdida en muchas especies de hongos pero mantenida aún en otros como Aspergillus, Talaromyces o Emonsia. La expresión del gen se analizó mediante PCR a tiempo real y análisis con microscopía confocal, observándose que el gen CgEP3 se expresaba durante las etapas más tempranas de la infección en planta. Por último, el estudio de transformantes delecionados en el gen CgEP3 mediante medición del área de lesión en la hoja y estimación de la biomasa utilizando PCR a tiempo real, indicó que los transformantes presentaban una acusada reducción de la virulencia con respecto a la cepa silvestre M1.001. En conjunto, estos resultados sugieren que CgEP3 se comporta como un efector, actuando durante las etapas más tempranas del proceso de antracnosis.