Participación de dni1+, dni2+ y prm1+ en la fusión celular durante la conjugación

Resum

La membrana plasmática forma la barrera que rodea a las células y consiste en una bicapa de fosfolípidos en la que se intercalan proteínas. Se trata de una estructura dinámica y no homogénea en la que sus componentes se encuentran en continuo movimiento (1). Dentro de la membrana coexisten distintos microdominios que se caracterizan por tratarse de regiones con características físicas diferentes a las de la membrana contigua. Difieren tanto en su composición como en la función específica que desempeñan (2). Las membranas biológicas pueden fusionarse generando una estructura continua y participando por tanto en multitud de procesos como la exocitosis, la formación de sincitios o la infección por virus. Para que dos membranas se puedan fusionar necesitan incorporar proteínas que regulen tanto la proximidad y curvatura, como la remodelación y cambios en la composición (3). El citoesqueleto de actina es esencial para la fusión de diversos tipos celulares como los osteoclastos, mioblastos y los gametos de levaduras (denominados shmoos) (4). La conjugación en Schizosaccaromyces pombe es el proceso mediante el cual dos shmoos se fusionan para dar lugar a un zigoto diploide (5). Constituye un modelo de fusión celular para el estudio de nuevas proteínas que intervienen en dicho proceso, así como para dilucidar sus mecanismos de funcionamiento y de regulación. Las claudinas son proteínas con cuatro dominios transmembrana, con los extremos N y C intracelulares. Forman parte de las uniones estrechas, estructuras que crean poros con una permeabilidad selectiva en las células epiteliales limitando el movimiento de material a través del espacio paracelular (6). Adicionalmente pueden restringir la difusión de lípidos y proteínas en la membrana plasmática (7). Los genes dni1+ y dni2+ de S. pombe codifican proteínas con similitud a claudinas y que intervienen en la fusión de shmoos (8). Su expresión aumenta considerablemente en los primeros estadíos de la conjugación. Por otro lado, la expresión del gen prm1+ también se incrementa en el mismo estadío y su homólogo en Saccharomyces cerevisiae es necesario para una correcta fusión celular durante conjugación (9). Durante el desarrollo de este trabajo se delecionó el gen prm1+ de S. pombe, y se observó que el mutante presentaba una acumulación de prezigotos, lo que indicó que podría estar relacionado con la fusión de membranas. Por esta razón se procedió a caracterizar este fenotipo y se observó que las membranas no llegaban a fusionarse, confirmando la implicación de Prm1p en la fusión celular. Estas membranas parecían estar desorganizadas ya que formaban acumulaciones y/o burbujas dentro del citoplasma. Se observó que estas burbujas eran retráctiles puesto que aparecían y desaparecían en cortos espacios de tiempo. Analizando el comportamiento de la fosfatidilserina, se detectaron diferencias entre el mutante prm1Δ respecto al WT. En la estirpe silvestre se produce una reorganización de este fosfolípido, de manera que deja de localizarse en la monocapa interna previamente a que la fusión de las membranas tenga lugar, situación que no se ha observado en la estirpe prm1Δ. Estos resultados indicaron que Prm1p pudiera estar mediando la comunicación entre membrana plasmática y pared celular así como participando en la correcta organización/dinámica de la membrana plasmática. Por otro lado, también se ha profundizado en el estudio de la función de Dni1p y Dni2p. De esta forma se ha observado que Dni1p parece actuar en el mantenimiento de una correcta organización de la membrana plasmática, ya que en su ausencia se produce una desorganización de la misma durante la conjugación, y el mutante es sensible a compuestos que interfieren con los lípidos de membrana. Se ha examinado si Dni1p y Dni2p son realmente claudinas mediante un análisis estructura-función de los elementos característicos de dicha familia de proteínas. Para ello, se ha estudiado la implicación de varias cisteínas conservadas en las claudinas y del extremo C terminal en su funcionalidad. Estos estudios han permitido derminar que las citadas características estructurales son necesarias para la correcta localización y función de Dni2p, pero no así para Dnip1, lo que ha permitido concluir que Dni2p sí que se comporta como una claudina, mientras que Dni1p parece ser que únicamente conserva la similitud en secuencia. Analizando la localización de cada una de las proteínas en ausencia de la otra se ha observado que Dni1p podría ayudar a Dni2p a salir del RE, mientras que Dni2p podría concentrar a Dni1p en un microdominio de membrana en el extremo polarizado del shmoo. Además se ha observado que una correcta organización de la actina así como de los esteroles son necesarios para que Dni1p se concentre en el microdominio de membrana y por tanto para que pueda llevar a cabo su función eficientemente. Asimismo, se han encontrado varios motivos small-xxx-small en las hélices transmembrana de estas proteínas. Dni2p contiene uno de estos motivos en el cuarto dominio transmembrana que favorece su oligomerización y que aparece conservado, al menos en secuencia, en las claudinas humanas. Dado que las tres proteínas que se han estudiado parecían presentar funciones muy parecidas era posible que pudieran estar relacionadas funcionalmente. Sin embargo, hemos observado que Prm1p actúa en una ruta funcional diferente a la de Dni1p-Dni2p, que por su parte sí que actúan en la misma ruta interaccionando físicamente. (1) Garth L. Nicolson (2013) The fluid-mosaic model of membrane structure: still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochim. Biophys. Acta. 81414 : 1-16 (2) Richard G. W. Anderson and Ken Jacobson (2002) A role for lipid shells in targeting proteins to caveolae, rafts, and other lipid domains. Science 296: 1821-1825 (3) Sascha Martens and Harvey T. McMahon (2008) Mechanisms of membrane fusion: disparate players and common principles. Molecular Cell Biology. 9: 543-556 (4) Omaya Dudin, Felipe O. Bendezú, Raphael Groux, Thierry Laroche, Arne Seitz and Sophie G. Martin (2015) A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. JCB. 208: 897-911 (5) Laura Merlini, Omaya Dudin and Sophie G. Martin (2013) Mate and fuse: haw cells do it. Open Biol 3: 1-8 (6) Julian Nomme, Aleksandar Antanasijevic, Michael Caffrey, Christina M. Van Itallie, James M. Anserson, Alan S. Fanning and Arnon Lavie (2015)Structural basis of a key factor regulating the affinity between the zonula occludens first PDZ domain and claudins. The journal of biological chemistry. 290:16595-16606 (7) Dorothee Günzel and Alan S. L. Yu (2013) Claudins and the modulation of tight junction permeability. Physiol Rev. 93(2): 525-569 (8) José Ángel Clemente-Ramos, Rebeca Martín-García, Mohammad R. Sharifmoghadam, Mami Konomi, Masako Osumi and M.-Henar Valdivieso (2009) The tetraspan protein Dni1p is required for correct membrane organization and cell wall remodelling during mating in Schizosaccharomyces pombe. Mol Microbiol. 73(4):695-709 (9) Heiman MG, Walter P. (2000) Prm1p, a pheromone-regulated multispanning membrane protein, facilitates plasma membrane fusion during yeast mating. J Cell Biol. 151(3):719-30