Aislamiento y analisis molecular del gen leu1 de phycomyces blakesleeanus y su expresion en mucor circinelloides

Zusammenfassung

Se ha aislado un fragmento de 3.4 kb hind iii-hind iii de adn de phycomyces blakesleeanus capaz de complementar al mutante r7b(leu) de mucor circinelloides. Para el escrutinio de una genoteca de phycomyces construida en el cosmido phs255, se han utilizado como sonda los fragmentos resultantes de la restriccion total, con la enzima sau3a, del fragmento psti-psti de adn, que contiene el gen de m circinelloides aislado por complementacion del mencionado mutante. La secuencia nucleotidica completa del fragmento hind iii-hind iii ha sido determinada y se ha identificado una fase de lectura de 2070 nucleotidos que presenta una homologia significativa (de mas del 60%) con la secuencia de aminoacidos de la proteina codificada por el gen leua de m. Circinelloides. Ademas, la proteina deducida a partir del gen leud de salmonella typhimurium (que codifica una de las dos subunidades de la alfa-ipm isomerasa), presenta tambien un alto porcentaje de homologia con el extremo carboxilo terminal de la proteina de phycomyces. Los analisis de hibridacion "northern" y la localizacion de los inicios de transcripcion han demostrado que el arnm transcrito de dicho gen tiene un tamaño de 2,68 kb y que las regiones 5' y 3' no traducidas tienen un tamaño aproximado de 355 y 250 nucleotidos respectivamente. La transformacion del mutante r7b de m. Circinelloides se realizo con una serie de plasmidos construidos a tal efecto, y que portaban el gen leu1 de phycomyces, ademas de secuencias ars de diferente procedencia. Las frecuencias de transformacion obtenidas con estos plasmidos varian entre 488 transformantes/ug con el gen de m. Circinelloides y 83 con el gen de p. Blakesleeanus en un plasmido que carece de origen de replicacion. Los plasmidos, como se puede deducir de los experimentos de tipo "southern" y los analisis de estabilidad mitotica de los plasmidos en los transformantes, se replican de manera autonoma en este organismo. Es esta la primera vez