Secrecion de proteinas heterologas en kluyveromyces lactis. Aislamiento y caracterizacion del gen klpho5 que codifica para una fosfatasa acida reprimible

Resumen

La levadura kluyveromyces lactis presenta una actividad fosfatasica acida mayoritaria con un ph optimo de 4,3. La enzima se encuentra localizada fuera de la membrana, principalmente en el espacio periplasmico y pared celular. Esta actividad fosfatasica es reprimible alcanzando en un medio con concentraciones de fosfato inorganico de 0,01 g/l valores entre 400 y 600 veces mayores que los detectados a concentraciones defosfato de 1 g/l. La enzima se ha purificado demostrandose que se trata de una glicoproteina con una masa molecular correspondiente a su parte proteica de 53 kd. Mediante tecnicas de pct a partir de dna genomico se ha aislado el gen codificante para esta actividad al que se ha denominado kipho5 y que se localiza en el cromosoma ii presenta una fase de lectura abierta de 1407 pb que codifica para una proteina compuesta por 469 aminoacidos. La transcripcion del gen origina un rna mensajero de 1,8 kb cuyo comienzo dterminado por la tecnica de "primer-extension" tiene lugar mayoritariamente en las posiciones 34, -35 y -40 antes del triplete de inicio de la traduccion. El analisis de la expresion del gen kipho5 indica que es reprimido por la presencia de fosfato inorganico en el medio de cultivo y que acontece a nivel transcripcional ya que el rna mensajero correpondiente solo aparece en ausencia de fosfato o con niveles menores a 0,01 g/l. El gen contenido en un plasmido multicopia complementa la mutacion pho5 en la estirpe acx1-2a de s. Cerevisiae, presentando una regulacion y comportamiento similar al gen pho5 cuando se intoduce en el mismo plasmido y se transforma esta misma cepa. El analisis de la region promotora del gen mediante deleciones sucesivas con exonucleasa iii revela la existencia de una secuencias indispensables para la expresion del gen entre las posiciones -456 y -352 de forma semejante a como acontece en el gen pho5 de s. Cerevisiae. La fusion traduccional de la region promotora y secuencia señal