Desarrollo de nuevas estrategias para diagnóstico y clasificación de inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos

Resumen

Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son el tipo de inmunodeficiencias primarias más común. Se caracterizan por presentar defectos en la producción de anticuerpos y un cuadro clínico muy heterogéneo, que incluye desde individuos asintomáticos hasta pacientes con infecciones recurrentes y otras complicaciones no infecciosas, como autoinmunidad y linfoproliferación, que pueden manifestarse a cualquier edad. La inmunodeficiencia variable común (IDVC) es la inmunodeficiencia predominantemente de anticuerpos más importante desde el punto de vista clínico, y los déficits de isotipos de inmunoglobulinas los más prevalentes. Ambos grupos de enfermedades se caracterizan, además de por su alta heterogeneidad clínica, por un origen genético desconocido en la gran mayoría de los casos, por lo que su diagnóstico debe realizarse basándose en una combinación de criterios clínicos y biológicos. Los niveles de anticuerpos séricos son el parámetro más utilizado tanto para su diagnóstico como para su subclasificación, aunque estos no reflejan de forma adecuada el estado de la respuesta B en un momento dado, ni permiten predecir el comportamiento clínico de estos pacientes a medio/largo plazo. Por ello, en los últimos años diferentes estudios han evaluado las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos B de sangre en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos, correlacionándolas además con sus manifestaciones clínicas. No obstante, estos trabajos solamente han evaluado un número limitado de poblaciones, no teniendo en cuenta las subpoblaciones definidas por los isotipos y subclases de inmunoglobulina expresada, ni utilizando valores de referencia por grupo de edad. Ante estos antecedentes, nos planteamos como objetivo principal del trabajo de tesis doctoral desarrollar una metodología que nos permitiera estudiar en profundidad las subpoblaciones de linfocitos B en sangre mediante citometría de flujo, incluyendo las definidas por el isotipo y subclase de inmunoglobulina, para establecer valores de referencia en donantes sanos por grupo de edad, y de este modo definir con mayor precisión las alteraciones observadas en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos. Para llevar a cabo este objetivo, en primer lugar evaluamos una serie de 28 clones de anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles y previamente validados para detectar anticuerpos séricos, dirigidos frente a las subclases de IgG e IgA. De estos, 17 fueron capaces de identificar las subclases de IgG e IgA en la superficie de los linfocitos B de memoria y células plasmáticas, de los cuales seleccionamos 6, uno frente a cada una de las subclases de IgG e IgA, de acuerdo a su intensidad de marcaje y su disponibilidad conjugados con fluorocromos compatibles. Posteriormente, estos clones fueron validados, demostrando ser capaces de identificar de forma sensible y específica su correspondiente subclase de inmunoglobulina en linfocitos B y células plasmáticas, tanto en sangre como en otros tejidos humanos, así como en la superficie y el citoplasma celular. Una vez que disponíamos de la metodología que nos permitía diseccionar las subpoblaciones de linfocitos B y células plasmáticas de acuerdo no solo a su estadio madurativo, sino también al isotipo y subclase de inmunoglobulina expresada, nuestro objetivo se centró en conocer en profundidad la distribución de estas poblaciones B a lo largo de la vida y compararla con los niveles solubles de anticuerpos en plasma. Para ello, analizamos un total de 19 muestras de sangre de cordón umbilical, y 215 muestras de sangre periférica de individuos de distintas edades, desde recién nacidos a mayores de 80 años. Nuestros resultados mostraron que las subpoblaciones de linfocitos B varían a lo largo de la vida, tanto las definidas por su estadio madurativo como por la expresión de inmunoglobulinas. Así, las células plasmáticas son el compartimento que alcanza sus niveles más altos a edades más tempranas, seguidas de los linfocitos B de memoria y los anticuerpos solubles de plasma. Además, aquellas subclases de inmunoglobulinas codificadas más distalmente en el gen IGHC alcanzan sus niveles más altos, tanto en los compartimentos celulares como solubles, a edades más avanzadas, probablemente reflejando la existencia de cambios de isotipo/subclase de inmunoglobulina consecutivos a lo largo de la vida. Tras la evaluación de las subpoblaciones de linfocitos B de acuerdo a la edad, nuestro siguiente objetivo fue la identificación precisa de las alteraciones de estas poblaciones en pacientes con IDVC y déficits de isotipos de inmunoglobulina, comparando los valores obtenidos con los de donantes sanos del mismo rango de edad. De este modo, pudimos identificar que todos los pacientes analizados presentan alteraciones en al menos una población de linfocitos B y células plasmáticas, observándose distintos patrones de alteración en función del diagnóstico del paciente. Los casos con déficit selectivo de IgA se caracterizan por presentar defectos en las poblaciones IgA, sin apenas alteraciones en las IgG. Además, identificamos dos grupos de pacientes con déficit selectivo de IgA en función del grado del defecto en los linfocitos B de memoria IgA, los cuáles presentan distinto comportamiento clínico. Así mismo, los pacientes con IDVC, se caracterizan todos ellos por presentar alteraciones en las células plasmáticas, y un deterioro progresivo en la capacidad de cambio secuencial de isotipo/subclase de inmunoglobulina en los linfocitos B de memoria, afectando primeramente a aquellos isotipos y subclases localizadas más distalmente en el gen IGHC. De este modo, según el patrón de alteración observado en los linfocitos B de memoria podemos identificar hasta 6 subgrupos de pacientes con IDVC, que a su vez presentan diferentes características clínicas. En definitiva, el análisis detallado del compartimento de células B, de acuerdo al isotipo y subclase de inmunoglobulina, y a la expresión de otros marcadores funcionales, como CD21 y CD27, constituye una herramienta valiosa y complementaria a los anticuerpos séricos para el diagnóstico, la clasificación y la monitorización de los pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos.