Caracterización del linfoma folicular y predicción de la transformación histológica a linfoma agresivomecanismos moleculares e implicaciones pronósticas

Zusammenfassung

La presente tesis doctoral se compone de tres capítulos que tienen como objetivo desentrañar la biología del linfoma folicular (LF) desde etapas iniciales de su desarrollo hasta etapas más avanzadas como su transformación histológica (TH), analizando los genes y lesiones genéticas involucradas en estos procesos. CAPÍTULO 1: Estudio del reordenamiento de los genes de la cadena pesada de las inmunoglobulinas en el linfoma folicular y su papel en la transformación histológica a linfoma agresivo. Introducción El LF es el segundo linfoma no Hodgkin (LNH) más frecuente caracterizado por su naturaleza indolente y heterogénea, cuya patogénesis permanece parcialmente desconocida. Se considera una enfermedad incurable en la que aproximadamente el 20% de los pacientes sufren una progresión temprana o son refractarios al tratamiento. Además, del 2 al 3% de los pacientes al año experimentan una TH a un linfoma más agresivo (LFt), considerado uno de los eventos más desfavorables en el pronóstico de los pacientes. La necesidad de identificar el grupo de pacientes de alto riesgo ha llevado al desarrollo de diversos índices pronósticos, pero ninguno de ellos es útil para predecir TH. Por ello, un mejor conocimiento de la biología de esta enfermedad permitiría identificar nuevos factores que al diagnóstico identifiquen de forma más precisa aquellos pacientes con mal pronóstico, para posibilitar el uso de estrategias terapéuticas adaptadas al riesgo. En este contexto, el estudio del repertorio de los genes IGHV y el estado de hipermutación somática (HMS), como parte de la biología de esta enfermedad, han sido escasamente analizados. A pesar de la importancia en otras neoplasias de célula B como la leucemia linfática crónica, en el LF sólo se han descrito series pequeñas y sin asociación clínico-pronóstica. Además, nunca se ha analizado su papel en el proceso de TH a linfoma agresivo. Objetivos El objetivo del presente capítulo es analizar en detalle el uso de los genes IGHV, IGHD e IGHJ y la tasa de HMS en la serie de pacientes con LF más grande descrita hasta la fecha, para mejorar nuestro conocimiento de la biología del LF y evaluar su impacto en la evolución clínica y el riesgo de TH. Los objetivos específicos fueron: 1) identificar las familias y genes IGHV, IGHD e IGHJ implicados en el reordenamiento V(D)J clonal de pacientes con LF; 2) estudiar su estado mutacional (HMS); 3) analizar el impacto de los genes IGHV más frecuentes y el estado mutacional en la evolución clínica de los pacientes con LF; y 4) analizar el papel de los genes IGHV en la TH de LF a linfoma agresivo. Pacientes y métodos Se estudiaron los genes IGHV, IGHD e IGHJ, y la tasa de HMS en la muestra tumoral de 187 pacientes con LF en el momento del diagnóstico, y su muestra pareada en el momento de la transformación en los 47 casos con TH. El reordenamiento clonal se identificó siguiendo el protocolo BIOMED-2 y posterior secuenciación mediante Sanger. Para el análisis de secuencias se empleó el software IMGT/VQUEST y para la comparación estadística se utilizó el programa SPSS 23.0. Las comparaciones múltiples se llevaron a cabo con el método bilateral del test de Fisher, utilizando el paquete informático GraphPad Prism 4.0 y los P-valor fueron corregidos mediante la corrección de Bonferroni (Pc). Resultados Se identificó un reordenamiento V(D)J clonal en 138 de 187 casos con LF (74%), observando un sesgo en el repertorio de genes IGHV detectados. Los genes más frecuentes en la presente serie fueron IGHV4-34 (14%), IGHV3-23 (14%), IGHV3-48 (10%), IGHV3-30 (9%) e IGHV3-21 (7%). De los 130 pacientes en que pudo estudiarse el estado mutacional de IGHV, sólo se identificaron 4 casos sin HMS (3%). La relación clonal entre muestras pareadas LF-LFt se confirmó en 45 casos de los 47 con TH, quedando dos casos excluidos de los análisis posteriores. Se observaron diferencias significativas al comparar las frecuencias de estos genes con las descritas en otras neoplasias de células B maduras y células B normales CD5-/IgM+, siendo el hallazgo más interesante la ausencia de los genes IGHV4-34 e IGHV3-30 en uno o ambos tipos de linfoma difuso de célula B grande (LDCBG) de novo, respectivamente, en comparación con su elevada frecuencia tanto en LF como en LFt. Por el contrario, al comparar los resultados obtenidos en la presente serie con los reportados en los pocos estudios publicados en LF hasta la fecha, las diferencias fueron escasas. Tampoco se observaron grandes diferencias en cuanto al impacto de los genes IGHV en la evolución clínica de los pacientes con LF. No obstante, los pacientes no mutados o con uso de la familia IGHV5 presentaron peor curso clínico y menor supervivencia que el resto de pacientes. Por otro lado, el gen IGHV3-48 se mostró como un factor de riesgo de TH a linfoma agresivo, ya que apareció sobrerrepresentado en los casos con LFt (19%) respecto al LF sin TH a 5 años (5%). En el análisis multivariante del riesgo de TH, las variables que mostraron un valor pronóstico e independiente fueron el uso del gen IGHV3-48 y no haber recibido tratamiento previo a la fecha de último seguimiento o TH. Discusión y conclusiones En el presente estudio, se ha observado un sesgo en el uso de genes IGHV específicos que sugiere la participación de ciertos antígenos en la estimulación de estas células con expresión de determinadas Igs de superficie. Las diferencias observadas respecto a otras neoplasias de célula B madura podrían resultar útiles en el diagnóstico diferencial, favoreciendo la distinción entre un LDCBG derivado de la TH de un LF y un LDCBG de novo. La aportación más novedosa del estudio fue el análisis del papel de los genes IGHV en la TH a linfoma agresivo. La selección del gen IGHV3-48 en el reordenamiento V(D)J parece asociarse con transformación a linfoma agresivo, lo que podría ser un biomarcador útil de TH. CAPÍTULO 2: Caracterización genómica de pacientes con linfoma folicular. Identificación de alteraciones génicas asociadas con la evolución clínica y aplicación del m7-FLIPI en nuestra serie. Introducción El LF continúa siendo una enfermedad incurable, a pesar de la mejora de sus resultados con la introducción del anti-CD20 rituximab. Por ello, son claves los modelos de riesgo que permiten la estratificación pronóstica de los pacientes, como es el índice pronóstico FLIPI. Sin embargo, sigue habiendo pacientes que progresan precozmente (< 24 meses tras inducción), incluyendo algunos clasificados en el grupo de bajo riesgo según este índice. La combinación de factores clínicos con marcadores genéticos podría mejorar la estratificación de los pacientes con LF. Pese a que se conoce el perfil mutacional del LF, su impacto clínico ha sido escasamente analizado, siendo en la mayoría estudios de genes aislados y, en muchas ocasiones, con resultados discordantes. Recientemente se ha propuesto un modelo de riesgo clínico-genético denominado m7-FLIPI, que integra el estado mutacional de 7 genes (EZH2, ARID1A, MEF2B, EP300, FOXO1, CREBBP, CARD11) con variables clínico-biológicas básicas (FLIPI, ECOG), y permite identificar pacientes con alto riesgo de fracaso terapéutico. Sin embargo, el m7-FLIPI no es capaz de discernir con precisión aquellos pacientes con progresión precoz, siendo además poco reproducible y escasamente validado a día de hoy. Objetivos El objetivo fue estudiar el perfil mutacional del LF y su impacto pronóstico en la evolución de pacientes no seleccionados con LF y tratados con R-QT como primera línea. Se analizó su asociación con supervivencia libre de fracaso terapéutico (SLFT) a 5 años, respuesta completa a los 30 meses desde la inducción (CR30) y supervivencia global (SG), además de su papel en el riesgo de TH. Pacientes y métodos Se incluyeron 83 pacientes con muestra tumoral en el momento del diagnóstico, 47 de los cuales recibieron esquemas de R-IQT. De cada paciente se incluyó una muestra no tumoral con el objetivo de excluir las variantes presentes en la línea germinal. Se estudió la región codificante de 66 genes descritos en patologías linfoides mediante dos paneles de secuenciación de nueva generación (NGS) de diseño propio, comparables entre sí. La secuenciación, análisis primario y análisis secundario se realizaron en un MiSeq (Illumina Inc.), y la anotación y filtrado de variantes se llevó a cabo con el software BaseSpace Variant Interpreter (Illumina Inc.). Sólo se consideraron las variantes con más de 100 lecturas y una frecuencia mínima de lecturas con la variante (VAF) del 5%. Resultados Se detectaron 548 variantes somáticas en 56 de los 66 genes analizados (84.8%), 14 de los cuales se vieron alterados en más del 10% de los pacientes (CREBBP 63.9% [n=53], KMT2D 55,4% [46], BCL2 41% [34], TNFRSF14 27,7% [23], EZH2 22.9% [19], STAT6 19.3% [12], ARID1A 18.1% [15], FOXO1 18.1% [15], CARD11 14.5% [12], EP300 14.5% [12], GNA13 13.2% [11], IRF8 12% [10], SMARCA4 12% [10] y HIST1H1E 10.8% [9]), siendo las categorías funcionales más frecuentemente alteradas modificación epigenética (96.4%), señalización (66.3%) y factores de transcripción (49.4%). Al analizar el impacto pronóstico del m7-FLIPI en aquellos pacientes tratados con R-IQT, no se observaron diferencias significativas en SLFT ni en SG en este grupo de pacientes. Sin embargo, cabe destacar que la presencia de 6 o más genes alterados se asoció con menor proporción de CR30 (28.6% vs. 82.6%, P < 0.01), SLFT más corta a 5 años (30% vs. 82%, P < 0.001) y menor SG a 10 años (49% vs. 76%, P < 0.05), de manera independiente al FLIPI. Además, las mutaciones en el gen EZH2 se asociaron a mayor proporción de CR30 (100% vs. 53.3%, P < 0.05), mientras que los pacientes con alteraciones en FOXO1 presentaron una SLFT a 5 años significativamente menor que el resto (25% vs. 68%, P < 0.05). Ninguna de las variables clínico-biológicas mostró asociación significativa con riesgo de TH a 10 años. Discusión y conclusiones Como resultado del estudio, se observó un sesgo en el perfil mutacional del LF a favor de los genes involucrados en epigenética, señalización y codificantes de factores de transcripción. Todos ellos tienen un importante papel en el mantenimiento del programa genético de la célula B centro germinal, en línea con lo descrito en estudios previos. A pesar de que el m7-FLIPI no predijo SLFT a 5 años en esta serie, probablemente por la inclusión de un menor número de pacientes en comparación con la serie original, la complejidad génica, definida por la presencia de alteraciones en 6 o más genes, mostró un importante papel en SLFT y SG, hecho que concuerda con lo descrito sobre alteraciones en el número de copias en LF. Además, las alteraciones en los genes EZH2 y FOXO1 también confirmaron su importancia en la evolución clínica de los pacientes, en línea con lo descrito previamente en LF. En conclusión, el presente trabajo amplia los conocimientos en la patogenia del LF y confirma la dependencia de la célula tumoral de las alteraciones en reguladores epigenéticos, señalización y factores de transcripción. El hallazgo más relevante fue la asociación entre el aumento de la complejidad génica y/o la presencia de mutaciones en el gen FOXO1 con una menor frecuencia de CR30, peor SLFT y menor SG en una serie de pacientes tratados homogéneamente, pudiendo discernir un subgrupo de mal pronóstico independientemente del FLIPI. La confirmación de estos resultados en una cohorte mayor e independiente permitiría desarrollar nuevos modelos predictores de riesgo para mejorar la estratificación de los pacientes con LF y desarrollar estrategias terapéuticas adaptadas al riesgo. CAPÍTULO 3: Estudio molecular de la progresión y transformación histológica del linfoma folicular a linfoma agresivo. Posibles modelos de evolución clonal en base a la experiencia de un solo centro. Introducción El 25-30% de los pacientes con LF experimentan TH a linfoma agresivo, generalmente LDCBG. La tasa de TH es del 2-3% por año y es considerado uno de los eventos de peor pronóstico para estos pacientes, ya que la curación con terapia convencional es poco frecuente. La patogénesis de este proceso no es bien conocida pese a que las técnicas de NGS permiten conocer factores de riesgo del proceso de TH como la activación de MYC o inactivación de los genes supresores de tumores CDKN2A/B y TP53. Estos eventos no son exclusivos de la TH, ya que también se han observado en la progresión del LF. Se ha postulado además la participación de otros genes en la TH como B2M, CD58, MYD88 o POU2AF1, si bien hay gran variabilidad entre estudios. Conocer el patrón de evolución del clon tumoral responsable tanto de la TH como de la progresión y/o recaídas recurrentes que caracterizan al LF podría facilitar un mejor conocimiento de la biología y patogenia de esta enfermedad. Se han postulado dos modelos de evolución clonal: i) lineal, con acumulación progresiva de lesiones genéticas, y ii) divergente, a partir de un clon progenitor común (CPC) que adquiere alteraciones propias y características de cada uno de los clones dominantes en cada etapa de la enfermedad. Sin embargo, la mayoría de estudios consideran solo una muestra representativa del LF y otra de la TH, sin análisis del resto de episodios de la enfermedad, limitando la información del modelo de evolución clonal. Objetivos Estudiar en detalle las alteraciones genéticas en cada uno de los episodios de la enfermedad (diagnóstico-recaída del LF-transformación) en pacientes que sufren TH de LF a linfoma agresivo, para identificar algún biomarcador que caracterice a este grupo de pacientes, y plantear posibles modelos de evolución clonal. Las alteraciones presentes en el LF transformado se compararán con una serie de pacientes sin TH con un seguimiento mínimo de 5 años (n=32) y con LDCBG de novo (n=30). Pacientes y métodos Se analizaron 16 pacientes con LF grado 1-3A que presentaron TH confirmada y muestra pareada LF-TH. En todos los casos se incluyó también muestra no tumoral pareada, y en 9 de ellos además muestra del momento de la recaída histológica como LF. Se estudió la región codificante de 66 genes, descritos en la literatura como relevantes en patología linfoide, mediante dos paneles de NGS de diseño propio basados en tecnología de amplicones y captura, comparables entre sí. La secuenciación, análisis primario y análisis secundario se realizaron en un MiSeq (Illumina Inc.), y la anotación y filtrado de variantes se llevó a cabo con el software BaseSpace Variant Interpreter (Illumina Inc.), considerando aquellas con un número de lecturas superior a 100x y una frecuencia mínima de lecturas con la variante (VAF) del 5%. Resultados Hubo un aumento en el número de genes alterados y de mutaciones al comparar las biopsias del diagnóstico con las del resto de episodios de la enfermedad. Los genes más comúnmente alterados en todos los episodios fueron CREBBP y KMT2D, presentes en todos los pacientes analizados, además de EZH2, BCL2, TNFRSF14, STAT6, ARID1A, IRF8 y FOXO1. En el análisis multivariante, las alteraciones en FOXO1 y el índice FLIPI fueron predictores de TH precoz de forma independiente. Por otro lado, se observaron alteraciones adquiridas en determinados momentos de la enfermedad, principalmente en genes relacionados con el ciclo celular. Es el caso de TP53 y CCND3, presentes recurrentemente en la TH, con TP53 alterado en un elevado porcentaje de casos en la recaída del LF. Otros genes, como MYD88, que han sido asociados a la TH, se observaron en etapas previas, sobre todo recaídas del LF. Otro hallazgo relevante fue la presencia de alteraciones en KRAS, NRAS y RHOA en la TH que no se observaron en el resto de etapas, ni tampoco en los pacientes con LF sin TH o LDCBG de novo. Con estos datos, se establecieron dos modelos de evolución clonal: lineal o secuencial (54% de los casos) y divergente o ramificada (46%). Las biopsias secuenciales demostraron la existencia en ambos modelos de un CPC con alteraciones en CREBBP y/o KMT2D, además de la t(14;18) presente en el 75% de los pacientes con TH. Dentro de cada modelo fueron detectadas variantes en función del origen de los clones responsables o dominantes en cada episodio de la enfermedad. No hubo diferencias significativas en la distribución de genes y las características clínicas entre los dos modelos. Discusión y conclusiones Se detectaron alteraciones específicas de fase que parecen mostrar un papel en la patogénesis de la TH, incluyendo alteraciones exclusivas no descritas en estudios previos (KRAS, NRAS, RHOA), incidiendo en la relevancia de la alteración del ciclo celular en la TH. De igual forma que en otras series, no se identificó un marcador o evento genético único responsable de la TH del LF a linfoma agresivo. Pese a ello, las alteraciones en FOXO1 podrían ser un factor predictor de TH precoz. En el estudio se confirmó la existencia de dos modelos de evolución clonal, lineal y divergente, a partir de un CPC. La inclusión de muestras de la recaída del LF ha permitido identificar nuevas variantes dentro de los mismos, sin que se observen diferencias clínicas o biológicas entre los modelos. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la complejidad genética característica de la patogenia del LF y su TH a linfoma agresivo, lo que sugiere la existencia de varios mecanismos que desencadenen la evolución del clon tumoral.