Las funciones de ftf2 y el cromosoma de patogenicidad de fusarium oxysporum

Resumen

Las interacciones entre las plantas y los organismos fitopatógenos están claramente influenciadas por una serie de factores entre los que se incluyen la disponibilidad de nutrientes, la presencia de otros organismos competidores en la rizosfera, el pH que rodea a la zona de interacción planta-patógeno, etc. El estudio de la influencia de estos y otros factores sobre las interacciones planta-patógeno posibilita el planteamiento de alternativas para evitar, o al menos minimizar, los daños ocasionados por los patógenos. Los hongos fitopatógenos son responsables de un porcentaje elevado de los daños observados en las plantas y, por tanto, de gran parte de las pérdidas totales de producción agrícola (Cuming, 2009; Fisher et al., 2012; Flood, 2010; Oerke, 2006). El quinto hongo fitopatógeno con mayor repercusión socio-económica y científica es Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr. (Dean et al., 2012), considerado un complejo de especies anamórficas que presentan variabilidad morfológica y fisiológica (O’Donnell et al., 2009). Este hongo, presente en suelos de todo el mundo creciendo de forma saprofítica o colonizando diversas especies vegetales (O’Donnell et al., 2009), es el agente causal de la fusariosis vascular o traqueomicosis. A pesar de que en conjunto el complejo de especies presenta un amplio rango de hospedador pudiendo infectar más de 100 hospedadores diferentes (Michielse y Rep, 2009; Nucci y Anaissie, 2007), los aislados de manera individual son capaces de colonizar una especie vegetal única o un grupo reducido de especies vegetales, lo que ha permitido clasificarlos en formae speciales (ff. spp.) en función de la especificidad de hospedador (Armstrong y Armstrong, 1975; Di et al., 2016; Snyder y Hansen, 1940). En nuestro grupo de investigación se aislaron y caracterizaron más de 140 aislados de la forma especial Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr f. sp. phaseoli J.B. Kendrich y W.C. Snyder a partir de plantas de judía con síntomas de fusariosis (Alves-Santos et al., 1999; Alves-Santos et al., 2002a). Estos aislados se agruparon en grados de virulencia de acuerdo a la escala CIAT. El diagnóstico de la enfermedad se vio facilitado por el diseño de un SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) con el que se identifican de forma específica estirpes muy virulentas de F. oxysporum (Alves-Santos et al., 2002b). El análisis de la secuencia del SCAR permitió identificar una ORF que fue denominada FTF1 (Fusarium Transcription Factor 1) y posteriormente, un segundo gen que se denominó FTF2 (Ramos et al., 2007). Los dos genes codifican para factores de transcripción específicos de hongos y comparten una elevada homología, lo que permitió agruparlos en la familia génica FTF (Niño-Sánchez et al., 2016). Mientras FTF2 es un gen de copia única bien conservado en todos los ascomicetos filamentosos (Niño-Sánchez et al., 2016), FTF1 es un gen multicopia exclusivo de aislados muy virulentos del complejo de especies F. oxysporum (Ramos et al., 2007). Los estudios llevados a cabo con esta familia génica han permitido conocer el papel de FTF1 y FTF2 como factores de virulencia en F. oxysporum (Niño-Sánchez et al., 2016; Ramos et al., 2007; de Vega-Bartol et al., 2011),. Se ha demostrado que FTF1 modula la virulencia actuando como regulador de la expresión de los genes SIX, codificadores para moléculas efectoras (van der Does et al., 2016; Niño-Sánchez et al., 2016); sin embargo, en el caso de FTF2 apenas se tiene información acerca de las dianas que son reguladas por él. En el trabajo presentado en esta Tesis Doctoral nos propusimos analizar la capacidad de colonización de plantas de judía común por parte de F. oxysporum f. sp. phaseoli, en primer lugar analizando la influencia que tiene la concentración de la fuente de carbono sobre la capacidad del hongo para modular el pH ambiental, modulación que ya se ha demostrado clave en la patogenicidad en otros sistemas (Prusky y Yakoby, 2003; Prusky et al., 2001; Prusky et al., 2016). Y por otro lado, estudiando el papel del factor de transcripción FTF2 en la colonización del hospedador. El Capítulo I describe la influencia de la disponibilidad de la fuente de carbono presente en el medio sobre la capacidad del hongo para modular el pH ambiental. Los hongos son capaces de modular el pH a través de la secreción de pequeñas moléculas orgánicas (Alkan et al., 2008; Bateman y Beer, 1965; Diéguez-Uribeondo et al., 2008; Eshel et al., 2002b; Manteau et al., 2003; Miyara et al., 2010; Miyara et al., 2012; O’Connell et al., 2012; Prusky et al., 2004; Ruijter et al., 1999) para alcanzar valores de pH óptimos para la infección sobre el hospedador (Alkan et al., 2008; Alkan et al., 2009; Barad et al., 2014; Miyara et al., 2010; Prusky y Yakoby, 2003). Por otro lado se ha sugerido un papel importante durante el proceso de infección para la fuente de carbono disponible en el medio, tanto en patógenos de post-cosecha (Prusky et al., 2016) como en patógenos radiculares (Compant et al., 2010; Lugtenberg et al., 1999). Analizamos el efecto de la concentración de la fuente de carbono sobre la capacidad del hongo para modular el pH evaluando los cambios del pH del medio extracelular y la acumulación de dos moléculas orgánicas (amonio y ácido glucónico) durante el cultivo in vitro de F. oxysporum en medio suplementado con una elevada (175 mM) o una baja (15 mM) concentración de sacarosa. Nuestros resultados demuestran la capacidad de alcalinización de F. oxysporum cuando es cultivado en concentraciones bajas de fuente de carbono (sacarosa 15 mM). Este efecto es causado por la acumulación en el medio del amonio secretado por el hongo. Sin embargo, cuando la fuente de carbono está presente en exceso (sacarosa 175 mM), se secretan pequeñas cantidades de ácido glucónico que no tienen ningún efecto en el pH del medio extracelular. Por tanto en este trabajo se han confirmado resultados previos de otros grupos de investigación que situaron a F. oxysporum dentro de los hongos alcalinizadores (Miyara et al., 2012; Prusky y Yakoby, 2003). Los trabajos realizados para dilucidar la regulación génica que subyace a la capacidad de modulación del pH por los hongos, han permitido identificar al factor de transcripción PacC como el máximo responsable de esa regulación a través de la regulación positiva que ejerce sobre genes alcalinos y la regulación negativa sobre genes ácidos (Alkan et al., 2013; Di Pietro et al., 2003; Ment et al., 2015; Peñalva y Arst, 2002; Tilburn et al., 1995). Este factor de transcripción se activa a través de varios procesos proteolíticos siempre en presencia de condiciones alcalinas en el medio de crecimiento (Arst Jr y Peñalva, 2003; Caracuel et al., 2003; Li y Mitchell, 1997; Orejas et al., 1995; Peñalva y Arst, 2002; Prusky y Yakoby, 2003; Tilburn et al., 1995). Una concentración reducida en la fuente de carbono es suficiente para inducir condiciones alcalinas, por lo que serían condiciones óptimas para la activación de PacC. Para confirmar esta hipótesis en la que la activación de PacC es dependiente de la concentración de la fuente de carbono, evaluamos la expresión del gen homónimo y de un conjunto de genes ácidos y alcalinos, presumiblemente regulados por PacC, en muestras de micelio incubadas en los dos medios indicados anteriormente. Los resultados demostraron que la expresión de PacC sólo se induce en condiciones de baja concentración en la fuente de carbono (sacarosa 15 mM). Por otro lado, el análisis de expresión de los genes presumiblemente regulados por PacC no mostró resultados claros para los genes ácidos, al no observarse una clara reducción en su expresión en condiciones alcalinas; para los genes alcalinos, sin embargo, se observó una inducción de expresión en las mismas condiciones, de forma paralela a la inducción de expresión observada previamente para PacC. Los resultados en conjunto sugieren un modelo de interacción de varios elementos, en el que la baja concentración de fuente de carbono induce condiciones alcalinas de crecimiento mediante la secreción y acumulación de amonio, que permiten la inducción de PacC, encargado de regular, positiva o negativamente, la expresión de un conjunto de genes implicados en la modulación de la virulencia fúngica. El Capítulo II está dedicado a la caracterización de FTF2 en F. oxysporum f. sp. phaseoli. FTF2 y su homólogo FTF1 han sido descritos como factores de transcripción del grupo de proteínas zinc cluster proteins (MacPherson et al., 2006; Schjerling y Holmberg, 1996) por contener un dominio de unión a ADN tipo dedo de zinc binuclear Zn(II)2Cys6 (Niño-Sánchez et al., 2016; Ramos et al., 2007). Aguas abajo del extremo carboxilo de ese dominio, ambas proteínas contienen otro dominio funcional, el dominio MHR o región de mediana homología (Niño-Sánchez et al., 2016; Ramos et al., 2007), encargado de la regulación de la especificidad de unión del dominio de unión a ADN (MacPherson et al., 2006; Schjerling y Holmberg, 1996). El modelado tridimensional del dominio MHR para FTF1 y FTF2 realizado, ha revelado la existencia de una estructura en forma de α-hélice en FTF2 y no en FTF1, que podría ser responsable de la especificidad de unión de FTF2 a ciertos loci a los que no se une FTF1. En este sentido esta estructura podría determinar las diferentes funciones asociadas a cada factor de transcripción. Se ha propuesto que, debido a que el origen más plausible para los parálogos de FTF1 está en la duplicación y divergencia de FTF2 (van der Does et al., 2016; Niño-Sánchez et al., 2016; Ramos et al., 2007), los factores de transcripción FTF2 y FTF1 podrían compartir algunas funciones, mientras que FTF1 habría perdido algunas o incluso adquirido funciones nuevas como consecuencia de la divergencia (van der Does et al., 2016; Niño-Sánchez et al., 2016). Las funciones asociadas exclusivamente a FTF2 fueron identificadas mediante la consecución y caracterización de mutantes nulos en el gen (ΔFTF2). Estos mutantes mostraron reducción en la tasa de esporulación en tiempos cortos de incubación en medio líquido respecto a la estirpe silvestre; durante su cultivo en medio sólido se observó una elevada producción de esporas de tipo macroconidio, esporas que, de forma casi exclusiva, se observan al final del proceso de infección sobre los tejidos del hospedador cuando éste ya está muerto (Leslie y Summerell, 2006). Estos resultados sugieren que FTF2 está implicado en algún paso, aún no identificado, de la regulación del proceso de esporulación del hongo. Por otro lado, el proceso de germinación estuvo adelantado en los mutantes ΔFTF2, al igual que ocurre con mutantes nulos en el gen EBR1 en Fusarium graminearum. EBR1 ha sido relacionado con la ruta de proteínas de tipo GTPasa encargada de regular la germinación en el hongo (Zhao et al., 2011). Según nuestros análisis transcriptómicos, la expresión del gen codificador para una proteína de tipo Ras-GTPasa (FOXG_09392), que se localiza próximo al extremo 3’ de FTF2, se encuentra drásticamente reducida en mutantes ΔFTF2 respecto a la estirpe silvestre. Por tanto, FTF2 podría tener un papel en la germinación del hongo regulando la expresión de genes codificadores de proteínas de tipo GTPasa. A tenor del fenotipo observado para mutantes silenciados en la familia FTF al completo y para mutantes con expresión constitutiva de una copia funcional de FTF1 que no muestran alteración alguna ni en germinación ni en esporulación (Niño-Sánchez et al., 2016), parece que ambos factores no comparten funciones en ninguno de estos dos procesos. Los ensayos de inoculación sobre plantas de judía común llevados a cabo con mutantes ΔFTF2 en este trabajo han demostrado que FTF2 es necesario para la completa virulencia de F. oxysporum, al igual que se demostró previamente para FTF1 (Niño-Sánchez et al., 2016; Ramos et al., 2007). El estudio mediante microscopía láser confocal del patrón de colonización de la planta por la estirpe mutante y la estirpe silvestre, demostró que la reducción en los síntomas de fusariosis en las plantas inoculadas con las estirpes ΔFTF2 se debió al retraso de éstas para penetrar y colonizar el sistema radicular. Además, los mutantes ΔFTF2 inducen la sobreexpresión de PR1, gen marcador de la respuesta defensiva del huésped mediada por ácido salicílico, lo que sugiere que FTF2 está implicado en la supresión de esta respuesta. Los análisis transcriptómicos realizados sobre muestras de ARN obtenidas de cultivos in vitro de las estirpes mutante ΔFTF2 y silvestre, identificaron dos loci codificadores para hidrofobinas de tipo II cuya expresión está drásticamente reducida en las estirpes ΔFTF2. Las hidrofobinas son proteínas implicadas en el enmascaramiento de las hifas y las esporas (Bayry et al., 2012) y son necesarias para la patogenicidad en Magnaporthe grisea (Kim et al., 2005). La expresión de uno de estos genes (FOXG_02746) se mostró inducida de manera específica durante la colonización del sistema radicular por la estirpe silvestre FOP-SP1. La inducción del locus FOXG_02746, codificador para una hidrofobina, específicamente durante la colonización del sistema radicular y el retraso en la colonización observado en los mutantes nulos en FTF2, sugieren un modelo para el reconocimiento del patógeno por el hospedador. En este modelo FTF2 activa a FOXG_02746 y la hidrobina codificada por este gen contribuye al enmascaramiento del hongo evitando el reconocimiento por el hospedador. Recientemente se ha sugerido que FTF2 también contribuye en la regulación de la expresión de los genes SIX en F. oxysporum f. sp. lycopersici (van der Does et al., 2016). Analizamos la expresión de los genes SIX1 y SIX6 en plantas de judía común inoculadas con las estirpes FOP-SP1ΔFTF2. Los resultados obtenidos han demostrado que FTF2 activa ambos genes, de igual forma que ya había sido demostrado previamente para FTF1 (Niño-Sánchez et al., 2016).