Arms coordina la diferenciación neuronal y la secreción mediada por neurotrofinas

Resumen

Durante el desarrollo del sistema nervioso las neuronas deben enviar proyecciones que les permitan establecer los contactos adecuados con las células diana. Este proceso se puede entender como una sucesión secuencial de siete etapas que dependen de diferentes señales químicas para iniciarse, terminar y repetirse: neurogénesis y gliogénesis; migración de las células; diferenciación; maduración (crecimiento de dendritas y axones); sinaptogénesis (formación de sinapsis); muerte celular (proceso de ¿poda¿ sináptica); y formación de la mielina (revisado en Kolb et al., 2011). Las neurotrofinas participan en el control de numerosos aspectos esenciales en el desarrollo del sistema nervioso, como son: la regulación de la supervivencia y la diferenciación neuronal, la formación de sinapsis y la plasticidad sináptica. Uno de los procesos donde el papel regulador de las neurotrofinas está muy bien caracterizado es el proceso de diferenciación neuronal, en el que controlan la elongación de las neuritas, el grado de ramificación de éstas así como la cantidad de espinas dendríticas (revisado en Bibel and Barde, 2000; Arévalo and Wu, 2006; Chao, 2003). Además, las neurotrofinas también son imprescindibles para el correcto funcionamiento del sistema nervioso adulto ya que participan en el control de la secreción y la actividad sináptica, siendo capaces de regular su propia secreción (Canossa et al., 1997; Krüttgen et al., 1998; Canossa et al., 2001; Amino et al., 2002; Mori et al., 2008). Analizando toda esta información, resulta llamativo que una misma molécula señalizadora, en este caso una neurotrofina, sea capaz de determinar en la célula receptora respuestas tan diferentes como la diferenciación neuronal y la estimulación de la secreción, dos procesos que forman parte de etapas diferentes del desarrollo del sistema nervioso. La diferenciación neuronal y la secreción se separan en el tiempo de tal modo que las células en desarrollo primero alcanzan los objetivos a inervar, y posteriormente establecen el contacto sináptico, tal y como se describe en Tau et al., 2010. Actualmente no se conoce el mecanismo molecular que permite a las células responder de maneras tan diversas a un mismo estímulo ni cómo estas posibles respuestas se regulan en las distintas etapas del desarrollo del sistema nervioso. En este trabajo hemos descrito una vía por la cual las neurotrofinas son capaces de ajustar las respuestas secretoras de las células neuronales en función de su grado de diferenciación, mediante un sistema que implica distintas interacciones proteína-proteína que se centralizan en el adaptador de los receptores de neurotrofinas ARMS. Las neurotrofinas regulan el proceso de diferenciación neuronal controlando la elongación y el grado de ramificación de las neuritas, así como la cantidad de espinas dendríticas (revisado en Bibel and Barde, 2000; Arévalo and Wu, 2006; Chao, 2003). Además, participan en el control de la secreción y la actividad sináptica, siendo capaces de regular su propia secreción (Canossa et al., 1997; Krüttgen et al., 1998; Canossa et al., 2001; Amino et al., 2002; Mori et al., 2008). Comenzamos este estudio trabajando con células PC12, un modelo establecido de célula neurosecretora que se diferencia a fenotipo neuronal en respuesta a distintos factores de crecimiento. En estas células pudimos comprobar que el NGF es capaz de estimular la secreción de las vesículas grandes de núcleo denso (LDCVs) empleando un ensayo de secreción de hormona de crecimiento humana (hGH) transfectada. Tras comprobar la relación de los receptores Trk y la ruta de las MAPK con la secreción mediada por NGF, focalizamos nuestro estudio en la proteína ARMS, capaz de interaccionar directamente con los receptores de neurotrofinas e implicada en la señalización de éstos hacia la ruta de las MAPK (Arévalo et al., 2004; Chang et al., 2004; Arévalo et al., 2006). Tras comprobar que ARMS regula negativamente la secreción mediada por NGF y que este efecto no está mediado por las MAP quinasas, realizamos un ensayo de dos híbridos en levaduras para tratar de encontrar nuevas proteínas que interaccionasen con ARMS y que pudieran estar regulando este mecanismo. En este ensayo identificamos a la proteína Sinembrina-B, un homólogo de la proteína Ric8 descrita en el nematodo Caenorhabditis elegans, donde regula el proceso de secreción de neurotransmisor modulando la producción y el consumo de DAG (Miller et al., 1996; Miller and Rand, 2000; Reynolds et al., 2005). Una vez verificada la interacción, comprobamos que Sinembrina-B también desempeña un papel relevante en la secreción mediada por NGF, produciendo efectos análogos a los de ARMS, y comprobamos que la presencia de ambas proteínas es necesaria para la regulación de la secreción en respuesta a NGF. Sinembrina-B había sido descrita como factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) inde-pendiente de receptor, capaz de actuar sobre subunidades monoméricas de las proteínas G¿s y G¿q (Tall et al., 2003; Romo et al., 2008; Chan et al., 2011) afectando indirectamente al efector de G¿q Trio, un GEF para las GTPasas Rac1 y RhoA (Williams et al., 2007). Sabiendo que Trio es capaz de interaccionar directamente con ARMS y que esta unión afecta a la activación de Rac1 (Neubrand et al., 2010), realizamos experimentos para detectar los niveles de activación de Rac1 y RhoA en respuesta a NGF manipulando los niveles de ARMS y Sinembrina-B. Con estos ensayos pudimos detectar una regulación positiva, mediada por ARMS y Sinembrina-B, sobre la activación de Rac1 y RhoA, que se rescata al utilizar inhibidores farmacológicos contra Trio o G¿q. Es interesante destacar que empleando estos inhibidores pudimos rescatar totalmente el efecto de la sobreexpresión de Sinembrina-B mientras que el efecto de la sobreexpresión de ARMS se recuperó sólo parcialmente. Este resultado apunta a otra vía por la cual ARMS pudiera afectar a la activación de Rac1 además de la descrita en este trabajo. Empleando dominantes negativos de Rac1 y RhoA, pudimos rescatar los efectos que la sobreexpresión de ARMS o Sinembrina-B tienen sobre la secreción mediada por NGF, estableciendo una correlación entre los niveles de Rac1 y RhoA activos y la regulación de la secreción mediada por NGF que ejercen ARMS y Sinembrina-B. Analizando la variación de los niveles de ARMS y Sinembrina-B que ocurre de manera fisiológica a lo largo del proceso de diferenciación mediada por NGF, encontramos una fuerte correlación entre los niveles de estas dos proteínas y la respuesta secretora al NGF en células PC12. Constatamos que en el inicio del proceso de diferenciación los niveles de ARMS y Sinembrina-B son muy elevados y las células no responden al NGF en términos de secreción. Sin embargo, una vez que se alcanza la diferenciación, los niveles de estas dos proteínas se reducen drásticamente y en ese momento el NGF resulta ser un potente secretagogo. Sorprendentemente, las variaciones en los niveles de ARMS y Sinembrina-B ocurren también durante la diferenciación de las células PC12 mediada por FGF, lo que implica que estos cambios responden al avance del proceso de diferenciación, independientemente del estímulo causante. Sabiendo que ARMS es imprescindible para el proceso de diferenciación, y que sus niveles son altos a lo largo del desarrollo, reduciéndose drásticamente una vez alcanzada la diferenciación (Arévalo et al., 2004; Arévalo et al., 2006; Wu et al., 2009; Neubrand et al., 2010; Chen et al., 2012), analizamos también la diferenciación mediada por NGF de las células PC12. Corroboramos esta información y detectamos que ARMS y Sinembrina-B son necesarias para el proceso de diferenciación. Además, encontramos que la sobreexpresión de ARMS agiliza el proceso, adelantando el momento en el que las células completan la diferenciación. Sin embargo, utilizando un inhibidor farmacológico específico para G¿q, pudimos apreciar que la vía a través de G¿q y Trio explica sólo parcialmente los efectos de ARMS en la diferenciación, lo que no es de extrañar ya que, como se describe en la sección ¿introducción¿, ARMS puede afectar a este proceso mediante multitud de vías. Una vez avanzada la caracterización de esta ruta de señalización en la línea celular PC12, verificamos tanto las variaciones en los niveles de ARMS y Sinembrina-B a lo largo del proceso de diferenciación neuronal, como sus efectos sobre la secreción de BDNF, en cultivos primarios de neuronas corticales de rata. Además, utilizando un ratón transgénico capaz de expresar, de manera inducible, un shRNA contra ARMS, demostramos que los niveles de ARMS afectan directamente a la secreción de BDNF en la corteza cerebral y tienen claras implicaciones en los niveles de BDNF que llegan hasta el estriado. De este trabajo hemos extraído las siguientes conclusiones: 1. La diferenciación neuronal y la secreción mediada por neurotrofinas están coordinadas en el tiempo, tanto en células PC12 como en neuronas corticales en cultivo. Esta coordinación implica que las neuronas no diferenciadas presentan una secreción regulada muy débil, mientras que las neuronas diferencidas son capaces de responder a determinados estímulos con potentes incrementos en su secreción. 2. Mientras que la diferenciación neuronal requiere niveles elevados de la proteína ARMS, el descenso de la cantidad de dicha proteína es necesario para la secreción evocada por neurotrofinas. Para modular la secreción regulada durante el desarrollo neuronal, ARMS forma un complejo proteico con Sinembrina-B que actúa a través de las proteínas G¿q, Trio, RhoA y Rac1. 3. ARMS y Sinembrina-B regulan la secreción de BDNF en respuesta a despolarización, NT-3 o NT-4 en neuronas corticales en cultivo. 4. Hemos generado una línea de ratones modificados genéticamente que permiten reducir los niveles de ARMS de manera controlada espacial y temporalmente. 5. Utilizando ratones condicionales para ARMS hemos confirmado in vivo la implicación de ARMS en la secreción del BDNF cortical en respuesta a despolarización, NT-3 o NT-4. Además hemos comprobado que estos animales muestran mayores niveles de BDNF en el estriado, donde el aporte pricipal de BDNF procede de proyecciones cortiocoestriatales. Teniendo en cuenta todo lo anterior y sabiendo que distintos grupos han publicado datos que muestran la caída de los niveles de ARMS como respuesta a la actividad sináptica (López-Menéndez et al., 2009; Wu et al., 2010), planteamos un modelo en el que ARMS favorece la diferenciación y actúa como un freno para la secreción hasta que se establecen los contactos con las dianas adecuadas, momento en el que los niveles de ARMS se reducirían permitiendo a las neurotrofinas estimular la secreción. Proponemos además que ARMS ejerce este control valiéndose de interacciones proteína-proteína con Sinembrina-B y Trio para regular indirectamente la activación de las GTPasas G¿q, Rac1 y RhoA.