Caracterización del transcriptoma y proteoma intestinal de ornithodoros moubata. Utilidad para la búsqueda de antígenos vacunales

Resum

La garrapata Ornithodoros moubata es un argásido africano distribuido por los países del este, centro y sur del continente (Vial, 2009; Quembo et al., 2016), donde transmite la Fiebre recurrente humana causada por Borrelia duttoni y la Peste porcina africana (PPA). La presencia de O. moubata en el entorno doméstico y peridoméstico contribuye a la persistencia de ambas enfermedades en las zonas endémicas y, además, representa un constante riesgo de propagación de dichas enfermedades hacia otras regiones (Cutler, 2010; Sánchez-Vizcaíno et al., 2015; Quembo et al., 2016). La prevención y control de dichas enfermedades requiere la eliminación de las poblaciones sinantrópicas de O. moubata. La aplicación de acaricidas como método de lucha frente a este argásido resulta ineficaz y, por tanto, se necesitan métodos alternativos de control, como podrían ser las vacunas anti-garrapata. Con ese objetivo, nuestro grupo inició el desarrollo de una vacuna anti-O. moubata evaluando la capacidad protectora de dos tipos de antígenos: salivales e intestinales. Los estudios con antígenos salivales nos permitieron identificar tres componentes antihemostáticos protectores que, administrados conjuntamente, proporcionan más de un 50% de eficacia protectora, lo cual los convierte en interesantes candidatos vacunales. Pero, pese a ello, aún no se ha podido obtener una vacuna que sea completamente eficaz frente a O. moubata y que esté basada únicamente en antígenos salivales (Díaz-Martín et al., 2015). Por su parte, la posibilidad de obtener respuestas protectoras más eficaces utilizando antígenos intestinales de O. moubata parecía más probable al ser este tipo de antígenos los utilizados en las dos únicas vacunas anti-garrapata eficaces comercializadas hasta la fecha, TickGARD© y GAVAC©. En nuestros estudios previos con O. moubata y con la especie ibérica Ornithodoros erraticus, la inmunización de animales con extractos de membrana del intestino indujo respuestas protectoras que redujeron significativamente la alimentación y fecundidad de las hembras (García Varas, 2004; Manzano-Román et al., 2006). En esos mismos estudios se comprobó que los antígenos responsables del efecto protector eran proteínas de la membrana luminal de los enterocitos y que su expresión aumentaba significativamente tras la ingestión de la sangre, alcanzando un máximo en torno a las 48 horas post-alimentación (Manzano-Román et al., 2007). Estas proteínas aún no han sido identificadas, pero los resultados anteriores confirman la capacidad protectora de los antígenos de membrana del intestino de ambas especies, convirtiendo al intestino medio de los ornithodoros en objetivo prioritario de estudio en la búsqueda e identificación de candidatos vacunales. El intestino medio de las garrapatas es el órgano encargado de digerir la sangre del hospedador y de absorber los nutrientes imprescindibles para su supervivencia y reproducción (Sojka et al., 2013). Además constituye la primera barrera defensiva a la que se enfrentan los microorganismos patógenos ingeridos con la sangre, la cual debe ser eficientemente superada por éstos para invadir y multiplicarse en otros órganos y, desde ellos, transmitirse a la siguiente fase evolutiva, a la descendencia y a otros hospedadores (Kocan et al., 2004). En definitiva, el intestino medio forma parte de la interfase hospedador-garrapata-patógeno y en él se expresan numerosas proteínas que intervienen en procesos fisiológicos vitales para la garrapata y/o en los mecanismos de invasión, multiplicación y transmisión de patógenos. Por tanto, dichas proteínas son de gran interés como candidatos antigénicos para el desarrollo de vacunas anti-garrapata y vacunas bloqueantes de la transmisión de enfermedades. Cabe esperar que ese conjunto de proteínas intestinales experimenten una expresión diferencial en respuesta al estímulo proporcionado por la fijación al hospedador y la ingestión de la sangre. Y de acuerdo con nuestras observaciones previas (Manzano-Román et al., 2007) y lo descrito por otros autores (Akov, 1982; Sojka et al., 2013), cabría esperar que las proteínas sobre-expresadas en torno a las 48 horas post-alimentación muestren un alto potencial protector. Estas proteínas, al ser antígenos ocultos no habrán sufrido la presión selectiva de la respuesta inmunitaria del hospedador, por lo que: (i) mantendrán una alta inmunogenicidad y es previsible que induzcan fuertes repuestas humorales si se administran artificialmente con adyuvantes; y (ii) es probable que estén conservadas en otros argásidos, e incluso en ixódidos, lo que permitiría utilizarlas en una vacuna de amplio espectro frente a estos vectores hematófagos. De dichas proteínas, las expresadas en la membrana plasmática luminal del enterocito (junto con las secretadas a la luz intestinal) son las más fácilmente accesibles a los efectores inmunes ingeridos con la sangre del hospedador (esencialmente, los anticuerpos y el complemento), por lo que serían las de primera elección como dianas vacunales. A la vista de lo anterior, y dado que en O. moubata se desconoce casi por completo la composición proteica de su tubo digestivo, en la presente tesis doctoral nos propusimos los siguientes OBJETIVOS GENERALES: (i) La obtención del mialoma (transcriptoma + proteoma) del intestino medio de O. moubata. (ii) El análisis comparado de dicho mialoma antes y después de la alimentación para identificar genes/proteínas expresados diferencialmente en respuesta a la digestión de la sangre. (iii) La selección de antígenos potencialmente protectores entre las proteínas de membrana sobre-expresadas tras la alimentación aplicando una estrategia de vacunología reversa e incluyendo la validación experimental de los candidatos en pruebas de inmunización de animales. La consecución de dichos objetivos generales se planteó a través de los siguientes OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Obtención del transcriptoma del intestino de hembras de O. moubata en ayunas y a las 48 horas post-alimentación. Anotación y comparación entre los dos estados fisiológicos. 2. Obtención del proteoma del intestino de hembras de O. moubata en ayunas y a las 48 horas post-alimentación. Anotación y comparación entre ambos estados fisiológicos. 3. Selección in silico de antígenos potencialmente protectores a partir de la información transcriptómica y proteómica basada, esencialmente, en criterios de inmunogenicidad, localización celular y sobreexpresión tras la alimentación. 4. Producción de formas recombinantes de los antígenos seleccionados en el objetivo anterior o bien diseño y síntesis química de péptidos antigénicos a partir de dichos candidatos. 5. Evaluación del efecto protector de las proteínas recombinantes y péptidos sintéticos frente a O. moubata y O. erraticus mediante experimentos de vacunación de conejos y validación, en su caso, como candidatos vacunales.