Caracterización genómica de la leucemia mieloblástica agudautilidad clínica del perfil molecular en el diagnóstico, pr

Resum

genéticas que afectan a los mecanismos normales de crecimiento, proliferación y diferenciación celular. Los hallazgos citogenéticos y moleculares han servido como marcadores diagnósticos para diversos subtipos de LMA dentro de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS), así como para establecer grupos de bajo, intermedio y alto riesgo (European LeukemiaNet), con claras diferencias a nivel de tasas de remisión completa, riesgo de recaída y supervivencia libre de enfermedad y global. Sin embargo, a pesar de cumplir los criterios recomendados para la categorización y el tratamiento de la LMA, los pacientes de un mismo subgrupo pueden tener una evolución clínica diferente. Este es el caso de la LMA de riesgo favorable, en la que no todos los pacientes presentan realmente un buen pronóstico. De hecho, hasta un 40% de los pacientes con LMA‐CBF termina recayendo, la mitad de los pacientes con mutaciones en NPM1 sufren recaída durante los 4 primeros años y las mutaciones bialélicas en CEBPα no evitan una tasa de recaída del 44%. En cuanto a las LPA, pese a las notables mejorías gracias a su tratamiento dirigido, aún aparecen casos que presentan resistencia o recaídas y, aunque se han encontrado mutaciones en los genes implicados en la fusión (PML y RARα) en casos de progresión, el perfil de aberraciones genéticas asociado a los tres subgrupos de LPA con distinto riesgo (score basado en cifras de plaquetas y leucocitos) aún no ha sido definido. Hoy en día, existe un creciente interés en detectar en un único test de secuenciación masiva (NGS) toda la variedad de alteraciones con valor diagnóstico y pronóstico en las LMA (mutaciones, traslocaciones/inversiones y variaciones en el número de copias). Sin embargo, son pocos los trabajos que estudian además de mutaciones génicas, el resto de alteraciones de las LMA, ya que todavía existen limitaciones técnicas para la detección de reordenamientos, por lo que los métodos convencionales continúan siendo imprescindibles. Para poder aplicar la técnica de NGS al estudio de estas alteraciones cromosómicas es necesario mejorar el diseño de los paneles y sobre todo simplificar el análisis informático de modo que pueda incorporarse a la práctica rutinaria del laboratorio clínico. Por otra parte, las mutaciones encontradas en las LMA no son solo adquiridas o somáticas, sino que también pueden presentarse en la línea germinal, dando lugar a casos de LMA familiares. Gracias al uso creciente de las nuevas tecnologías de NGS, se van descubriendo cada vez más hemopatías malignas heredables y genes responsables de ello, habiéndose descrito varios síndromes de predisposición familiar. De hecho, estos hallazgos clínico‐genéticos se recogen ya en la última clasificación de la OMS (2016), donde se ha incorporado una nueva categoría diagnóstica provisional que engloba los tumores mieloides hereditarios. No obstante, la investigación sobre LMA familiar a nivel molecular sigue siendo limitada. Aunque se han descrito casos con mutaciones en CEBPα o GATA2 y casos de trastorno plaquetario familiar con predisposición a LMA con mutaciones en RUNX1, es difícil una caracterización molecular completa con las técnicas convencionales, así como la monitorización correcta de los familiares sanos. Por último, la detección de enfermedad mínima residual (EMR) constituye uno de los factores pronósticos post‐tratamiento más importantes a la hora de tomar decisiones terapéuticas, ya que la ausencia de EMR aún no se ha traducido en la predicción inequívoca de curación de la enfermedad. Hay que destacar que solo el 40‐60% de los pacientes con LMA tienen un marcador de EMR robusto cuantificable por PCR, por lo que existe un número importante de pacientes en los cuales es imposible la monitorización molecular de la enfermedad. En este contexto, nos proponemos confirmar las siguientes hipótesis: 1. La variabilidad en la evolución de la LMA de bajo riesgo genético se debe a las características biológicas del clon tumoral: presencia de mutaciones o expresión anómala de diferentes genes. Un estudio genómico y de expresión génica de la LMA de bajo riesgo, permitirá esclarecer las posibles alteraciones responsables del comportamiento más agresivo de la enfermedad en dicho subgrupo. 2. El análisis genómico para la detección simultánea de reordenamientos cromosómicos y mutaciones somáticas de las LMA mediante un único panel de secuenciación masiva, permitirá demostrar sus ventajas sobre las técnicas citogenéticas y moleculares convencionales. Su implementación en el laboratorio clínico constituirá una estrategia innovadora para mejorar el manejo de los pacientes. 3. El empleo de paneles de NGS dirigidos es útil para analizar las mutaciones en genes relacionados con predisposición genética en los casos de LMA familiar, permitiendo la identificación de miembros en riesgo o afectados dentro de una familia. Además, se podrá determinar el origen germinal de la enfermedad y así plantear una estrategia terapéutica adaptada en la que se elimine la opción de trasplante alogénico emparentado. 4. El estudio de la sobreexpresión de los genes WT1, PRAME y BAALC en la monitorización de EMR resultará útil en los pacientes en los que no se dispone de un marcador fiable para seguimiento. Las conclusiones derivadas de los resultados obtenidos fueron las siguientes: PRIMER TRABAJO — En relación con la caracterización molecular de las LMA de bajo riesgo genético (LPA, LMA‐CBF, LMA‐NPM1 y LMA‐biCEBPΑ): 1. El estudio de expresión génica mediante tarjetas microfluídicas es útil para identificar pacientes con alteraciones citogenéticas/moleculares de bajo riesgo, permitiendo discriminar los distintos subgrupos con gran precisión. 2. El análisis mediante secuenciación masiva dirigida permitió determinar que las categorías funcionales de genes y su frecuencia de mutación difieren entre los subgrupos de LMA de bajo riesgo, lo que refleja procesos leucemogénicos distintos. Cabe destacar la alta incidencia de mutaciones en los genes implicados en metilación del ADN en las LMA‐NPM1, encontrándose mutados en el 80% de los pacientes. 3. La presencia de ciertas alteraciones moleculares puede explicar la evolución más agresiva de algunos pacientes de bajo riesgo, como la sobreexpresión de CD34 y las mutaciones en los genes de splicing en las LMA‐NPM1, así como las mutaciones en los genes de las cohesinas en las LMACBF. Sin embargo, el factor pronóstico con mayor valor es el número de mutaciones génicas al diagnóstico, independientemente de los genes implicados. 4. En nuestra serie, las mutaciones de sobreactivación de genes de la vía RAS al diagnóstico tienen una influencia negativa en la supervivencia libre de recaída de los pacientes con LMA‐CBF y LPA de bajo riesgo. De confirmarse estos datos, se podrían plantear nuevos enfoques en el tratamiento y monitorización terapéutica de estas LMA. 5. El perfil mutacional de las LPA difiere entre los tres grupos con distinto riesgo, clasificados según las cifras de leucocitos y plaquetas, observándose una mayor incidencia de FLT3‐ITD en el grupo de alto riesgo. SEGUNDO TRABAJO — En relación con la nueva estrategia de secuenciación masiva para la detección de reordenamientos y mutaciones en LMA: 1. La estrategia de NGS basada en captura desarrollada y validada en el presente trabajo permite analizar en un solo test tanto las mutaciones puntuales como los reordenamientos (traslocaciones e inversiones) que afectan recurrentemente a las células leucémicas, lo que supone un avance en el diagnóstico de precisión de estas enfermedades. 2. La metodología de NGS basada en captura se postula como futura técnica de elección para una caracterización completa de la enfermedad al diagnóstico, ya que además de presentar alta concordancia con las técnicas convencionales, identifica otras alteraciones no detectadas por las mismas, como las traslocaciones t(1;17)‐IRF2BP2/RARA y la t (3;21)‐RUNX1/LRRC34, no descritas hasta la fecha. 3. El algoritmo de libre acceso Lumpy resulta el más adecuado y fiable para la identificación de traslocaciones e inversiones en datos de NGS. Sin embargo, es necesario implementar herramientas bioinformáticas de análisis más eficaces y sencillas para el laboratorio clínico de rutina. TERCER TRABAJO — En relación con el análisis genético de la LMA familiar: 1. La incorporación de la NGS en la práctica clínica constituye una herramienta muy valiosa para mejorar el diagnóstico molecular en los casos de LMA familiar. 2. Las alteraciones germinales en el gen RUNX1 son un factor de predisposición a LMA, sin embargo, no son suficientes para la leucemogénesis, siendo necesarias mutaciones en genes adicionales, como TP53, para desarrollar el proceso maligno. 3. Existen casos de LMA familiar con mutaciones en RUNX1 sin antecedentes de trombopenia, en los que el estudio genético resulta de especial interés para asegurar un diagnóstico preciso y evitar la opción de trasplante alogénico emparentado. CUARTO TRABAJO — En relación con la sobreexpresión de WT1, PRAME y BAALC como marcadores de enfermedad mínima residual (EMR) en pacientes con LMA no promielocítica: 1. La cuantificación de la expresión de WT1, PRAME o BAALC tras el tratamiento de inducción en pacientes en remisión completa permite identificar pacientes con un riesgo de recaída significativamente mayor, lo que sugiere la necesidad de una monitorización más estrecha de los casos positivos. 2. En los pacientes sometidos a trasplante de progenitores hematopoyéticos, el estudio de PRAME en muestras previas y el de WT1 en muestras posteriores al trasplante (día +100), permite seleccionar un grupo de pacientes con un riesgo de recaída significativamente más alto. 3. La cuantificación de los niveles de WT1, PRAME y BAALC, además de los marcadores estándar (NPM1 mutado o tránscrito de fusión), permitieron la detección precoz de más del 90% de las recaídas analizadas, siendo WT1 el marcador con mayor tasa de falsos negativos. 4. La sobreexpresión de WT1, PRAME y BAALC es estable entre el diagnóstico y la recaída y su evolución es comparable con la de otros marcadores estándar, por lo que pueden emplearse para la detección de EMR en pacientes que no disponen de un marcador robusto.