Estudios filogenéticos y taxonómicos en los géneros Inula L. y Filago L. (Asteraceae)

Résumé

I. Introducción Una de las líneas de investigación desarrollada por el GIR (Grupo de Investigación Reconocido) BIOCONS (Biodiversidad, Sistemática y Conservación de Plantas Vasculares y Hongos) con sede en el Departamento de Botánica y Fisiología Vegetal de la Universidad de Salamanca, es la caracterización de la diversidad florística existente en la Península Ibérica e Islas Baleares a través de una participación continuada en el proyecto nacional Flora iberica. Esta línea de trabajo ha permitido el desarrollo de dos tesis doctorales que han precedido y motivado los trabajos incluidos en esta memoria doctoral. El género Inula L. en su circunscripción tradicional (Anderberg, 2009), abarca cerca de 100 especies distribuidas por los continentes del Viejo Mundo y algunas naturalizadas en América. La especie tipo designada para el género es I. helenium L. (Hitchcock & Green, 1929). Las especies pertenecientes a este género son en su gran mayoría hierbas perennes, o excepcionalmente plantas de porte arbustivo. Los capítulos, generalmente radiados y que llevan llamativas flores amarillas, se caracterizan por poseer varias filas imbricadas de brácteas externas, carecer de páleas en el receptáculo; y los aquenios presentan un vilano simple con pelos escábridos. En la actualidad es aceptado que la circunscripción del género Inula es parafilética en su sentido tradicional (Anderberg, 1991b; Englund et al., 2009) sobre la base de diferentes caracteres morfológicos, cariológicos y moleculares. En cuanto al otro género objeto de esta tesis, Filago L., engloba aproximadamente 45 especies (Galbany-Casals et al., 2010) distribuidas en Europa, Asia y el Norte de África, y algunas introducidas y más o menos naturalizadas en otras partes del mundo. La especie tipo del género Filago es F. pyramidata L. (Hitchcock & Green, 1929). Se caracterizan por ser pequeñas hierbas anuales. Los capítulos se disponen en una sinflorescencia más o menos contraída, en forma de glomérulos subglobosos o pulviniformes que rodeados por las hojas involucrantes, actúan en su conjunto como un capítulo secundario; generalmente, los capítulos han perdido las brácteas del involucro, cuya función ha sido asumida por la paleas del receptáculo, las cuales se han desarrollado considerablemente, presentan frecuentemente una flor filiforme en la axila y se disponen bien en filas verticales, o bien de manera helicoidal, rodeando en su conjunto a un grupo de flores hermafroditas (en ocasiones funcionalmente masculinas) que se sitúan en el centro de la inflorescencia. El corto ciclo de vida que presentan las especies de Filago  marcadamente condicionado por el régimen anual de precipitaciones y el pequeño tamaño de estas plantas, junto con la ausencia de caracteres diagnósticos netos en algunas especies, han contribuido a dificultar la delimitación taxonómica del género y a provocar frecuentes errores de determinación que han oscurecido el discernimiento de ciertos taxones. Actualmente, el género Inula se clasifica en la tribu Inuleae Cass., mientras que Filago pertenece a la tribu Gnaphalieae (Cass.) Lecoq & Juill. No obstante, las posibles afinidades taxonómicas de los géneros Inula y Filago han sido interpretadas de diferentes maneras por los distintos autores a lo largo de las historia. En ciertos momentos fueron considerados géneros que estaban relativamente próximos, siendo clasificados en muchas ocasiones en la misma tribu tribe (Inuleae sensu Cassini, 1822; Bentham, 1873; Merxmüller et al., 1977. Astereae sensu Lessing, 1832). Anderberg (1989) realizó un análisis cladístico de toda la tribu Inuleae sensu Merxmüller et al. (1977), y sobre la base de sus resultados la dividió en tres tribus: Inuleae, Gnaphalieae y Plucheae. La clasificación de Anderberg (1989) ha sido apoyada por análisis moleculares posteriores (Kim & Jensen, 1995; Eldenäs et al., 1999) y constituye el tratamiento seguido por Funk et al. (2009), la obra actual de referencia para el estudio de las Compuestas. Uno de los problemas taxonómicos del género Inula es su delimitación. Diversos trabajos (Anderberg et al., 2005; Englund et al., 2009; Nylinder & Anderberg, 2015) basados en el análisis de diferentes datos moleculares (principalmente secuencias espaciadoras del ADN ribosómico nuclear y de regiones del ADN plastidial) han reafirmado el estatus parafilético del género Inula en su circunscripción tradicional. En estos trabajos I. helenium siempre se recupera en una posición filogenética más cercana a otros géneros (v.gr., Carpesium L., Telekia Baumg.) del Inula complex (i.e., Amblyocarpum Fish. & C.A.Mey, Carpesium, Chrysophthalmum Sch. Bip., Inula, Pentanema Cass,, Rhanteriopsis Rauschert, Telekia y Varthemia DC.) que a un gran grupo de especies pertenecientes a Inula con distribución euroasiática [v.gr., I. conyzae (Griess.) Meikle, I. montana L., I. bifrons L., I. oculus-christi L. entre otras]. Otro de los problemas taxonómicos en este género está relacionado con la variabilidad de ciertos caracteres morfológicos en algunas especies del género Inula (v.gr., indumento, forma de la hoja). Esto queda patente en el trabajo de varios autores, pues ha dado pie a la descripción de numerosas especies, híbridos, o formas de escasa validez dentro de la variabilidad morfológica de una especie determinada ya bien reconocida. Por citar un ejemplo, en el caso de la Península Ibérica destacan los trabajos de Carlos Pau Español, que a lo largo de su prolija producción florística-taxonómica describe 20 taxones diferentes que actualmente están en sinonimia de I. helenioides DC (v.gr., I. asteriscus Pau, I. casaviellae Pau, I. hispanica Pau, I. stenophylla Sennen & Pau, I. turolensis Pau). En otros casos, el estatus taxonómico de ciertas plantas ha estado en entredicho debido a similitudes morfológicas con especies de distribución más amplia. Esta situación viene representada por la especie I. langeana Beck que ha sido descrita como híbrido [v.gr., I. x senenii Pau (=I. montana x I. vulgaris); I. x gutierrezii Pau (=I. conyzae x lutescens)] o subordinada en el nivel de subespecie [i.e., I. conyzae subsp. sennenii Pau; I. conyzae subsp. gutierrezii (Pau) Galán Cela] aunque autores contemporáneos ya la consideran en el nivel taxonómico de especie (i.e., Aseginolaza et al., 1984, I. sennenii Pau; Romero & Rico, 1989, I. langeana; Santos-Vicente, 2013). Todavía no ha sido aceptado ningún tratamiento alternativo para el Inula complex que refleje de manera correcta las relaciones evolutivas de los géneros que lo integran, a pesar del estatus parafilético tanto de Inula como de Pentanema. Tampoco existe ningún estudio pormenorizado que confirme la identidad de algunos taxones ibéricos y su posible origen, ni que explique las relaciones filogenéticas existentes entre los mismos. La delimitación de Filago y de los géneros afines a Filago ha variado de forma considerable a lo largo de la historia. Esto se debe principalmente a causa de las similitudes morfológicas que presentan las plantas adscritas a este grupo (Filago group sensu Anderberg, 1991a). Galbany-Casals et al. (2010) presenta la primera filogenia molecular para el grupo Filago y propone un nuevo tratamiento para Filago, el cual se desarrolla en Andrés-Sánchez et al. (2011). En este tratamiento, se reconocen cuatro subgéneros diferentes dentro de Filago: F. subgen. Crocidion Andrés-Sánchez & Galbany, F. subgen. Filago, F. subgen. Oglifa (Cass.) Gren. y F. subgen. Pseudevax (DC.) Andrés-Sánchez & Galbany. Este tratamiento ha sido apoyado por trabajos posteriores realizados con datos del tamaño genómico (Andrés-Sánchez et al., 2013b) y de la morfología del aquenio (Andrés-Sánchez et al., 2015). A pesar de que estos trabajos contribuyeron a ampliar netamente el conocimiento sobre el género, parece necesario incluir un mayor número de muestras en futuros análisis filogenéticos, ya que la gran plasticidad morfológica de las especies de este grupo complica su delimitación (Wagenitz, 1969; Galbany-Casals et al., 2010) y debido también a que, en algunos casos (Galbany-Casals et al., 2010), se ha encontrado cierto grado de diversidad molecular intraespecífica. Es de especial interés ampliar el esfuerzo de muestreo en los clados escasamente representados en futuros análisis. En adición, la escasa resolución que presentan los marcadores moleculares utilizados en estos estudios anteriores no permite discernir las relaciones de parentesco entre cada uno de los clados identificados para F. subgen. Filago, razón por la que es preciso buscar un marcador molecular que muestre mayor variabilidad en dicho nivel de estudio. A partir de los conocimientos previos que poseíamos acerca de los géneros Inula y Filago al inicio de esta tesis doctoral, se plantea para el desarrollo de la misma el cumplimiento de los siguientes objetivos: 1- Comprobar el estatus monofilético del Inula complex (sensu Englund et al., 2009) mediante una filogenia molecular que incluya un mayor número de especies y un mayor número de individuos por especie que las anteriormente publicadas por otros autores, analizar las relaciones filogenéticas existentes entre dichas especies y evaluar el estatus monofilético de las mismas. 2- Realizar las propuestas nomenclaturales pertinentes para obtener una delimitación monofilética de los géneros que componen el Inula complex y explorar la variabilidad morfológica de los mismos con el fin de buscar caracteres que apoyen esas decisiones taxonómicas. 3- Efectuar un análisis de variabilidad y estructuración genética a nivel interespecífico, así como una revisión de material de herbario de las especies de Inula incluidas en el “Inula conyzae clade”, distribuidas en el Mediterráneo occidental. Tratar de confirmar si dichas especies son o no monofiléticas, conocer los procesos implicados en la evolución del grupo y proponer claves para las especies cuya identificación ha resultado tradicionalmente más difícil. 4- Realizar una revisión morfológica en las especies pertenecientes al “Filago desertorum clade” –F. desertorum y F. mareotica– y explorar su variabilidad genética en la Peninsula Ibérica y Norte de África mediante un marcador de huella genética tipo AFLP. Confirmar o no la monofilia de dichas especies. 5- Investigar la posición filogenética de otras especies norteafricanas de Filago no incluidas en trabajos anteriores y realizar un tratamiento nomenclatural y descripciones completas para dichas especies. 6- Desarrollar un marcador molecular tipo SSR (Simple Sequence Repeat) que presente la variabilidad necesaria para resolver las relaciones de parentesco entre los diferentes clados reconocidos en F. subgen. Filago sensu Galbany-Casals et al. (2010).   II. Phylogeny of the Inula group (Asteraceae: Inuleae): evidence from nuclear and plastid genomes and a recircumscription of Pentanema. Taxon. en prensa. La tribu Inuleae está formada por dos linajes principales: las subtribus Inulinae y Plucheinae. Las especies incluidas dentro de Inulinae poseen un cristal de oxalato en cada una de las células de la epidermis del aquenio, carácter considerado sinapomorfía de grupo para Inuleae-Inulinae (Eldenäs et al., 1999; Anderberg et al., 2005). La circunscripción de la mayoría de los géneros incluidos en Inuleae-Inulinae es problemática (Englund et al., 2009), y muchos de ellos incluido Inula son parefiléticos en su circunscripción actual (Nylinder & Anderberg, 2015). Por esta razón, en este trabajo se pretende investigar la posición filogenética de de las especies europeas de Inula dentro del Inula complex y explorar que procesos and intervenido en la diversificación del grupo. A partir de estos datos se intenta establecer la circunscripción de los distintos géneros que conforman el complejo así como proponer las combinaciones que sean necesarias. En este trabajo se presenta una filogenia de las especies incluidas en el Inula complex (Englund et al., 2009) con particular énfasis en aquellas distribuidas en Europa. Para este trabajo se seleccionó una región del ADN ribosómico nuclear (ITS) y tres regiones espaciadoras del ADN plastidial (trnQ-rps16, trnL-rpl32 and rpl32-ndhF). Se analizaron un total de 324 secuencias de ADN, de las cuales se generaron en este trabajo 294. Se evaluaron las relaciones evolutivas entre las muestras incluidas en el estudio mediante dos aproximaciones. En la primera se comprobó la posición filogenética de las especies europeas de Inula dentro del Inula complex. Con este objetivo se seleccionaron como set de datos En (dataset 1) 99 muestras correspondientes a 59 taxa, cubriendo cerca del 25% de la representación de las especies aceptadas actualmente en Inula [i.e., todas las especies de Inula europeas y del norte de África junto con I. orientalis Lam., I. auriculata Wall., I. grandis Schrenk, I. peacockiana (Aitch. & Hemsl.) Korovin e I. mariae Bordz. como especies provenientes de Asia; e I. confertiflora A. Rich., I. shirensis Oliv. e I. paniculata (Klatt) Burtt Davy como especies representantes del centro y sur de África]. Además se analizaron la mayoría de especies que componen el resto de géneros incluidos en el Inula complex [i.e., Carpesium (8 de las 25 especies que componen el género), Chrysophthalmum (3 de las 5 especies del género), Rhanteriopsis (2 de las 4 especies del género), junto con los géneros monoespecíficos Telekia y Varthemia]. El único género no incluido en el estudio fue Amblyocarpum compuesto por una especie distribuida en la zona del Mar Caspio. Como grupos hermanos se incluyeron varias especies del Pulicaria complex y del Caesulina-Blumea clade. Finalmente, se eligió Stenachaenium campestre Baker, especie perteneciente a la subtribe Inuleae-Plucheinae como grupo externo para enraizar el árbol filogenético. En la segunda aproximación se analizaron 73 muestras correspondientes a 34 especies pertenecientes al Inula complex e incluidas en los análisis de la primera aproximación (dataset 2) con el objetivo de comprobar la existencia de posibles incongruencias entre las topologías obtenidas a partir de los dos tipos de marcadores (ADN nuclear y ADN plastidial). Para este segundo análisis se designó Pulicaria dysenterica Gaertn. (perteneciente al Pulicaria complex) y Pentanema indicum (L.) Y.Ling [especie recuperada en el Duhaldea-Caesulia-Blumea clade (Englund et al., 2009)] como grupo externo. Para el dataset 1 resultaron congruentes las topologías obtenidas mediante el análisis bayesiano (BA), el análisis de máxima parsimonia (ML), y el análisis de máxima verosimilitud (ML). La subtribu Inulinae y el Inula complex se recuperan como grupos monofiléticos, por lo menos para el análisis BA y en congruencia con estudios anteriores (Eldenäs et al., 1998; Anderberg et al., 2005; Englund et al.; 2009). Se pueden distinguir cuatro clados diferentes en el Inula complex. El cado A incluye I. helenium junto a otras cuatro especies pertenecientes a Inula (i.e., I. grandis, I. shirensis., I. paniculata and I. peacockiana) y Telekia especiosa. Inula grandis e I. peacockiana se recuperan juntas, en una relación de grupo hermano a la especie Telekia speciosa. El clado B incluye dos especies de Chrysophthalmum junto a seis especies de Carpesium en una relación no resuelta. Los clados C y D se recuperan en una relación bien apoyada como grupos hermanos. El clado C contiene dos especies de Rhanteriopsis claramente recuperadas como monofiléticas, y cinco muestras de la especie Chrysophthalmum montanum (DC.) Boiss. Finalmente, el cado D contiene el resto de especies europeas consideradas en Inula junto con otros taxones provenientes de Asia y de África. Este clado D está formado por dos subclados. El subclado D1 contiene un grupo de especies diploides Inula spiraeifolia L., I. ensifolia L., I. helvetica Weber, I. germanica L., I. salicina L. e I. hirta L. Este grupo de especies ya ha sido reconocido por otros autores en trabajos anteriores, sobre la base de caracteres morfológicos y moleculares (Beck, 1882; Anderberg, 1991b; Englund et al., 2009). El clado D2 está formado por un grupo de especies poliploides ordenadas en cuatro grupos. El primero de estos incluye dos especies de Pentanema (i.e., P. multicaule Boiss. and P. divaricatum Cass.). El segundo está formado por I. confertiflora, especie distribuida en el Cuerno de África. El tercero es un subclado que contiene especímenes de I. conyzae, I. bifrons. and Varthemia persica DC. Finalmente, el cuarto y último grupo está compuesto por tres clados menores: el primero incluye las especies I. orientalis e I. auriculata; el segundo está formado por I. britannica, I. helenioides, I. oculus-christi e I. mariae; y el tercer y último sublclado está compuesto por Inula verbascifolia Hausskn., e I. aschersoniana Janka, plantas de la Península Balcanica y Anatólia junto con I. montana, I. langeana Beck e I. maletii Maire, un conjunto de especies endémicas del Mediterráneo occidental. Los resultados obtenidos en este estudio concuerdan con los trabajos publicados con anterioridad (Anderberg et al., 2005; Pornpongrungrueng et al., 2007; Englund et al., 2009; Santos-Vicente, 2013; Nylinder & Anderberg, 2015) y demuestran que el Inula complex es monofilético, y que sin embargo algunos géneros incluidos en él son parafiléticos (i.e., Chrysophthalmum, Inula y Pentanema). Por esta razón, los géneros Inula y Pentanema han sido considerados por algunos autores como géneros “cajón de sastre” (Duman & Anderberg, 1999) dentro del Inula complex. Hay una serie de caracteres que permiten distinguir I. helenium del resto de especies recuperadas en el clado D. Inula helenium presenta canales resiníferos en el tallo a diferencia de las especies recuperadas en el clado D que no los tienen. Las brácteas externas del involucro en I. helenium son de ovado a ovado-trapezoidales y de mayor tamaño que las de las especies recuperadas en el clado D, cuyas brácteas externas son de menor tamaño y de linear a ovado-lanceoladas. También difieren en el tamaño y la forma del aquenio; en I. helenium los aquenios son prismáticos (tetragonales) y de un tamaño de 3 – 4 [5] mm de largo/longitud, mientras que en las especies recuperadas en el clado D los aquenios son oblongos o ligeramente comprimidos en el ápice y de 0.5 – 3 mm de largo. El número de pelos en el vilano es mayor en I. helenium (50 – 80 [65]) que en las especies recuperadas en el clado D (<45). Finalmente, I. helenium tiene un número básico de cromosomas de x = 10, mientras que los recuentos disponibles para las especies recuperadas en el clado D indican un número básico de cromosomas de x = 8, una clara sinapomorfía de este grupo. A raíz de los resultados obtenidos se propone una nueva delimitación para Inula y Pentanema. Dado que la especie tipo de Pentanema es P. divaricatum, y las muestras correspondientes a esta especie se recuperan en el clado D junto con el resto de representantes euroasiáticos y africanos de Inula, y que el nombre Pentanema tiene prioridad frente a Varthemia (también recuperado en el clado D), se transfieren las especies de Inula recuperados en el clado D, así como V. persica al género Pentanema. Finalmente se proporciona una nueva descripción para Pentanema y 24 nuevas combinaciones en Pentanema. Pentanema indicum aparece en el Duhaldea-Caesulia-Blumea clade, además presenta un número básico de cromosomas diferente (x = 9) al resto de especies incluidas en Pentanema en su nueva circunscripción. Por esta razón se recupera el género Vicoa Cass. para esta especie [Vicoa india (L.) DC.]. El género Inula en su nueva circunscripción corresponde con Inula s.s. sensu Anderberg (1991b) y estaría compuesto por I. helenium –especie tipo del género–, I. magnifica, I. racemosa o I. royleana. El género estaría caracterizado por ser hierbas altas con canales resiníferos en el tallo y capítulos radiados. Además de I. helenium, en el clado A encontramos cuatro especies de Inula, pero que sin embargo se encuentran en subclados diferentes al de esta especie. Por esto se recuperan los géneros Codonocephalum Fenzl [que incluye Codonocephalum peacockianum Aitch. & Hemsl. y Codonocephalum grande (Schrenk ex Fisch. & C.A.Mey.) B.Fedtsch.] y Monactinocephalus Klatt para Monactinocephalus paniculatus Klatt y Monactinocephalus shirensis (Oliv.) D.Gut.Larr, M.Santos-Vicente, Anderb., E.Rico & M.M.Mart.Ort. y Vicoa lignea (Mesfin) D.Gut.Larr. et al. En el análisis del dataset 2 se ha detectado cierto nivel de incongruencia entre las topologías obtenidas mediante datos provenientes del ADN plastidial y nuclear. Las relaciones filogenéticas entre los clados A y B, particularmente entre las muestras correspondientes a especies de Carpesium y Chrysophthalmum no se resuelven para ninguna de las topologías. Los bajos niveles de resolución obtenidos mediante el análisis del ADN plastidial pueden explicar incongruencias relativas a la posición en la que se recuperan las muestras de Telekia speciosa, Codonocephalum grande, Pentanema aschersonianum, P. britannicum o P. helenioides en las topologías correspondientes al ADN rn y el ADN cp. Considerando el papel que han podido tener diferentes eventos de poliploidización en la evolución de las especies recuperadas en el subclado D2, y teniendo en cuenta que se han registrado poblaciones con varios niveles de ploidia (Santos-Vicente et al., 2013), podemos afirmar que los patrones de reticulación detectados en este clado pueden explicarse por eventos de hibridación e introgresión. Dado que diferentes eventos de poliploidización pueden haber jugado un papel importante en el desarrollo del grupo, es necesario plantear futuros estudios mediante nuevas aproximaciones para considerar estas cuestiones.   III. Ahondado en el conocimiento taxonómico de las especies representantes del Pentanema conyzae clade en el Mediterráneo occidental mediante análisis de huella genética El género Pentanema en su delimitación actual (Gutiérrez-Larruscain et al., en prensa) está representado por ca. 40 especies distribuidas en Asia, África y Europa, de las cuales doce habitan en el Mediterráneo occidental. Los análisis presentados en Gutiérrez-Larruscain et al. (en prensa) recuperan dos linajes principales para el género Pentanema: el clado D1 o “Pentanema salicinum clade” y el clado D2 o “Pentanema conyzae clade”. El primero es un grupo de especies bien definido por otros autores en trabajos anteriores (Beck, 1882; Anderberg, 1991b), que engloba a una serie de especies [i.e., P. ensifolium (L.) D.Gut.Larr., M.Santos-Vicente, Anderb., E.Rico & M.M.Mart.Ort., P. germanicum (L.) D.Gut.Larr. et al., P. helveticum (Weber) D.Gut.Larr. et al., P. hirtum (L.) D.Gut.Larr. et al., P. salicinum (L.) D.Gut.Larr. et al. y P. spiraeifolium (L.) D.Gut.Larr. et al] caracterizadas por tener hojas más o menos coriáceas, flores liguladas que sobrepasan ampliamente las brácteas, aquenio glabro y nivel de ploidía 2n = 2x =16. El linaje D2 o “Pentanema conyzae clade” está formado por cuatro sublinajes muy heterogéneos en cuanto a la morfología y el nivel de ploidía de las especies que lo componen. El foco de este estudio está dirigido hacia las siete especies de este último clado “Pentanema conyzae clade” que crecen en el Mediterráneo occidental: P. bifrons (L.) D.Gut.Larr. et al., P. britannicum (L.) D.Gut.Larr. et al., P. conyzae (Griess.) D.Gut.Larr. et al., P. helenioides (DC.) D.Gut.Larr. et al., P. langeanum (Beck) D.Gut.Larr. et al., P. maletii (Maire) D.Gut.Larr. et al. y P. montanum (L.) D.Gut.Larr. et al. Pentanema britannicum y P. helenioides son dos especies que muestran un gran rango de variabilidad morfológica. Este hecho que ha complicado su identificación, particularmente en el área de distribución que comparten. Dado que la distribución de P. britannicum en la Península Ibérica tiene un marcado carácter finícola, con escasas poblaciones que se corresponden con el límite occidental de su distribución, y que estas son difíciles de diferenciar de P. heleniodes, algunos errores de identificación han ocasionado que algunos autores hayan excluido la presencia de P. britannicum en la Península Ibérica (Uribe-Echebarria, 2008; Santos-Vicente, 2013). Pentanema langeanum es una planta endémica del C y N de la Península Ibérica cuyo estatus taxonómico ha sido controvertido debido a su similitud morfológica con P. conyzae. Fue descrita como un híbrido [I. vulgaris (Lam.) Trevis (=P. conyzae) ⨯ taxón ibérico desconocido] por Beck (1882) y posteriormente considerada por multitud de autores como especie de origen híbrido bajo diferentes combinaciones {Pau, 1904, I ⨯ gutierrezii Pau [I. conyzae ⨯ lutescens Pau]; Pau 1907, I. ⨯ sennenii Pau [I. montana ⨯ vulgaris (=P. conzyae) Pau]}; o bien como taxón subordinado a I. conyzae [Losa & Montserrat, 1953, I. conyzae subsp. sennenii Pau; Galán Cela, 1989, I. conyzae subsp. gutierrezii (Pau) Galán Cela]. Sin embargo, algunos autores recientes han mantenido el tratamiento a nivel específico bajo diferentes combinaciones (Aseginolaza et al., 1984, I. sennenii Pau; Romero & Rico, 1989, I. langeana). Pentanema maletii es una especie endémica del Atlas Medio con escasa representación en los herbarios; junto con P. montanum, son las únicas especies del género Pentanema que alcanzan el norte de África. La falta de información sobre la variabilidad genética interpoblacional de estas especies, unido a los problemas taxonómicos anteriormente citados demandan la necesidad de realizar un estudio más detallado. Para ello, considerando los bajos niveles de variación encontrados dentro del grupo en análisis filogenéticos anteriores que utilizaron secuencias de ADN plastidial y ribosomal (Gutiérrez-Larruscain et al., en prensa), se ha realizado un análisis de huella genética tipo AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism) Los objetivos del presente estudio son los siguientes: (1) comprobar la monofilia de las especies de Pentanema distribuidas en el Península Ibérica y NW de África, y explorar la estructura y variabilidad genética interpoblacional utilizando un marcador de huella genética basado en ADN total; (2) llevar a cabo una revisión de material de herbario a fin de explorar aquellos caracteres que mejor permitan discriminar entre las especies objeto de estudio; (3) sobre la base de los resultados obtenidos, tratar de resolver los problemas taxonómicos anteriormente citados y de elaborar claves de determinación que permitan diferenciar entre las especies implicadas que más comúnmente se han confundido entre sí. Se llevó a cabo una revisión de material de herbario y se genotiparon 223 individuos pertenecientes a 41 poblaciones de las especies objeto de estudio. Se seleccionó como grupo externo dos poblaciones correspondientes a dos especies (P. helveticum y P. salicinum) recuperadas en el “Pentanema salicinum clade” (Gutiérrez-Larruscain et al., en prensa). Se escogieron los siguientes cebadores para la amplificación selectiva: EcoRI-ACT(6-FAM)/MseI-CAG, EcoRI-AGG(VIC)/MseI-CAC y EcoRI-ACC(NED)/MseI-CAT; fluorocromos entre paréntesis]. Se llevó a cabo un análisis de ordenación PCoA basado en una matriz construida mediante la distancia de Dice (Dice, 1945; Lowe et al., 2004) para una primera visualización de la estructura de los datos. Se realizó un análisis NeighborNet (NNet) mediante la distancia de Jaccard. Se analizó la estructura genética poblacional mediante el método de agrupamiento genético STRUCTURE 2.3.4. Se exploraron valores para el valor K (número óptimo de grupos genéticos) entre 1 y 11. El valor óptimo de K se estimó usando el parámetro ad hoc (ΔK statistic) propuesto por Evanno et al. (2005). Tanto el análisis de ordenación PCoA, como la NNet presentan una estructuración bien definida, con asignación de cada una de las muestras al grupo correspondiente a su especie y coincidiendo, por tanto, con la determinación inicial del material. La red muestra alta reticulación para los ejemplares de P. langeanum, los cuales se posicionan en nodos entre P. montanum y P. conyzae. Dos poblaciones de P. helenioides (MO6147, MO6146) se agrupan en una posición intermedia entre el grupo de muestras correspondiente a P. helenioides y el de P. britannicum. Finalmente dos poblaciones Ibéricas (ER8303, MO6143) de P. britannicum se emplazan junto a las muestras europeas de la misma especie. Las especies consideras en el análisis se recuperan como monofiléticas según los datos de AFLPs tratados con métodos fenéticos de reconstrucción, lo cual está en correspondencia con lo hallado por Gutiérrez-Larruscain et al., (en prensa), sobre la base de reconstrucciones filogenéticas basadas en datos de secuencia de ADN. Se confirma por primera vez la presencia de P. britannicum en la Península Ibérica mediante datos moleculares. Además se han detectado dos poblaciones (MO6147, MO6146) en las que su estructura genética parece indicar un posible contacto reciente entre P. britannicum y P. helenioides. No obstante, es necesario disponer de otro tipo de datos (v.gr., estudios cariológicos, estudios de cruzamiento) para comprender la biología de estas formas intermedias y poder interpretarlas correctamente. En el caso P. langeanum, sobre la base de nuestros resultados consideramos un posible evento o varios, dado que los diferentes niveles de ploidía registrados (Santos-Vicente et al., 2013), pueden indicar un origen politópico de estas plantas de hibridación por alopoliploidización entre taxones precursores de P. montanum y P. conyzae como origen de P. langeanum. También proponemos un evento de hibridación ancestral entre P. montanum y P. bifrons, o más probablemente entre algunos de sus ancestros, como origen de la especie hipotéticamente alopoliploide P. maletii. Se aportan claves de identificación para algunas de las especies incluidas en este trabajo.   IV. Overlooked singularity and tiny plants: the Filago desertorum clade (Gnaphalieae, Asteraceae). Bot. J. Linn. Soc., 2015, 179: 742754. El género Filago L. (Asteraceae) está ampliamente representado en el Hemisferio Norte, donde se encuentran las zonas con mayor riqueza de especies (i.e., Península Ibérica, Norte de Marruecos, Norte de Argelia cuenca del mar Egeo, Oriente Medio y Egipto) las cuales son consideradas putativas áreas de diversificación del género. Filago ha sido recientemente delimitado sobre la base de datos provenientes del análisis de secuencias del ADN nuclear y plastidial (Galbany-Casals et al., 2010), caracteres morfológicos (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2011; 2015) y evidencias relativas al tamaño del genoma (Andrés-Sánchez et al., 2013b). Es monofilético en su delimitación actual e independiente de los géneros Logfia Cass. (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2013a) y Bombycilaena (DC.) Smoljan. (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez, Martínez-Ortega & Rico, 2014). De acuerdo a su nueva circunscripción Filago está formado por ca. 40 especies, aunque la delimitación de las mismas no es sencilla. Esto se debe a la falta de caracteres diagnósticos y a que muchos de los que han sido considerados relevantes para la taxonomía del grupo probablemente están afectados por fenómenos de homoplasia (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2015). Además, el aspecto general de los individuos pertenecientes a una misma población es muy variable, dado que su morfología se ve afectada por las condiciones climatológicas de cada año (observación personal), lo que complica la detección de caracteres morfológicos con potencial valor taxonómico. Se considera de manera tradicional después de los minuciosos estudios realizados por Wagenitz (1968) que los individuos de Filago distribuidos en las zonas semidesérticas del SE Ibérico, Islas Canarias, N de África y SO de Asia con pelos en el margen de las paleas internas se encuentran dentro de la variabilidad morfológica de la especie Filago desertorum Pomel. Wagenitz (1968) comentó en sus estudios la gran variabilidad morfológica que presentan los individuos asignados a F. desertorum, e indica que las plantas identificadas bajo este taxón podrían tratarse en realidad de un complejo de especies. No obstante, Wagenitz no encontró ningún carácter morfológico durante el transcurso de su revisión taxonómica, ni ningún patrón geográfico o ecológico, que le permitiera describir algún taxón nuevo entre la variabilidad de las plantas asignadas a F. desertorum. Durante el transcurso de la revisión taxonómica del género Filago para Flora iberica [Castroviejo (Coord. Gen.), 1986-2013] se han encontrado varios caracteres morfologicos diferenciales, entre los individuos asignado a F. desertorum Pomel distribuidos en la Península Ibérica y el NO de Marruecos. Para este trabajo se ha realizado una intensa revisión de material de herbario con el objetivo de confirmar los caracteres diferenciales con valor taxonómico encontrados para este grupo de estudio. Además, trabajos previos han demostrado que es necesario el uso de datos moleculares para realizar estudios taxonómicos en el género Filago, ya que muchos caracteres morfológicos están afectados por la homoplasia. Teniendo en cuenta esta premisa, hemos escogido un método de análisis que parte de la fragmentación total del ADN, i.e., Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) con el objetivo de explorar las afinidades filogenéticas de dos especies muy cercanas (F. mareotica Delile, F. desertorum) incluidas en el “Filago desertorum clade” (Galbany-Casals et al., 2010), y establecer los límites taxonómicos entre ambas. Nuestros objetivos en este trabajo son (1) comprobar si la especie tradicionalmente nombrada F. desertorum es monofilética; y (2) evaluar la entidad taxonómica de las plantas pertenecientes al género Filago del NO de Marruecos y SE de España con pelos en el margen de las paleas internas. Se llevó a cabo una revisión de material asignado a F. desertorum (a partir de aquí, F. desertorum s.l.) proveniente de varios herbarios. Para el análisis AFLP se seleccionaron tres combinaciones de cebadores para los AFLP (fluorocromos entre paréntesis): EcoRI-AGA(6-FAM)/MseI-CC, EcoRI-ACT(6-FAM)/MseI-CTC and EcoRI-AGG(VIC)/MseI-CTC. El ADN se estrajo de material desecado en gel de sílice de un total de 71 individuos, los cuales corresponden a 19 poblaciones recolectadas en el N de África, Península Ibérica e Islas Canarias e identificadas como F. desertorum s.l. (17 poblaciones) y F. mareotica (2 poblaciones). Como grupo externo para el análisis Neighbor-Joining (NJ) se seleccionó una población de F. lutescens Jord. La selección del grupo externo se hizo sobre la base de los resultados de Galbany-Casals et al. (2010). Se realizó un análisis NJ para una primera visualización de la estructura de los datos mediante la distancia de Nei-Li (Nei & Li, 1979). Se llevó a cabo un análisis de ordenación PCoA basado en una matriz construida mediante la distancia de Dice (Dice, 1945; Lowe, et al., 2004). Se analizó la estructura genética poblacional mediante el método de agrupamiento genético STRUCTURE 2.3.4. Se exploraron valores para el valor K (número óptimo de grupos genéticos) mediante 5 carreras para cada valor de K entre 2 y 19. El valor óptimo de K se estimó usando el parámetro ad hoc (ΔK statistic) propuesto por Evanno et al. (2005), El análisis morfológico del material de herbario mostró que es sencillo diferenciar entre F. mareotica y F. desertorum; mientras que F. mareotica tiene capítulos solitarios, normalmente dispuestos en monocasios; F. desertorum s.l. presenta glomérulos de capítulos, dispuestos como un dicasio o pleocasio. Entre las muestras de F. desertorum s.l. se identificaron dos morfotipos en la revisión de herbario. El primero de ellos, denominado a partir de ahora F. desertorum s.s., tiene paleas externas vilosas-tomentosas, capítulos y glomérulos viloso-tomentosos (debido a que la cara abaxial de las paleas externas es vilosa-tomentosa), y capítulos ovados con cinco ángulos débilmente marcados. Este morfotipo está distribuido en el SE de Ásia (de Oriente Medio a India), N de Africa (de Egipto a Marruecos, pero restringido al sur del Atlas) e Islas Canarias. Por otro lado, los individuos asignados al “morfotipo castroviejoi” se caracterizan por poseer paleas externas de glabras a subglabras, capítulos y glomérulos de glabros a subglabros (debido a la que la cara abaxial de las paleas externas es glabra, o con algunos pelos aislados cerca del margen), y capítulos piramidales con cinco ángulos fuertemente marcados. Estas plantas crecen en la Península Ibérica y en el NE de Marruecos (restringidos al norte del Atlas). Tanto el análisis NJ como el PCoA muestran que la variabilidad genética de los especímenes analizados se estructuran en cuatro grupos correspondientes con dos de las especies estudiadas (i.e., F. mareotica, F. lutescens), y con los dos morfotipos anteriormente asignados a la variabilidad de F. desertorum. El análisis bayesiano de la estructura poblacional determina un valor máximo ΔK = 975.842032 para un óptimo de grupos genéticos de K=3. Uno de estos grupos se corresponde con las muestras asignadas a F. mareotica, mientras que los otros dos grupos genéticos restantes coinciden con los dos morfotipos detectados para F. desertorum s.l.: “F. desertorum s.s.” y “morfotipo castroviejoi”. Filago desertorum ha sido considerado de manera tradicional una especie de distribución amplia con una buena delimitación morfológica (Wagenitz, 1968). Tanto los resultados del análisis AFLP presentados en este trabajo, como el alto nivel de variabilidad intraespecífica detectado para dos muestras de F. desertorum en Galbany-Casals et al. (2010), coinciden en que F. desertorum s.l. no es una entidad monofilética. Los datos genéticos soportan el reconocimiento de al menos dos taxones independientes dentro de la variabilidad de los individuos de Filago desertorum s.l. caracterizados por tener pelos en el margen de las brácteas internas. Un análisis morfológico superficial puede revelar que ambas entidades taxonómicas son muy similares, pero tras la minuciosa revisión de material vegetal existen una serie de caracteres morfológicos que permiten la diferenciación de los dos grupos genéticos detectados por los marcadores moleculares. Estos morfotipos están distribuidos alopátricamente, mientras que “F. desertorum s.s.” tiene una clara distribución Saharo-Sindica, Irano-Turaniana y Macaronésica; el “morfotipo castroviejoi” está restringido al SE de la Península Ibérica y al NE de Marruecos al norte del Atlas. Sobre la base de estas evidencias, consideramos que el “morfotipo castroviejoi” debe ser reconocido al nivel taxonómico de especie como Filago castroviejoi Andrés-Sánchez, D.Gut.Larr., E Rico & M.M.Mart.Ort. FILAGO CASTROVIEJOI ANDRÉS-SÁNCHEZ, D.GUT.LARR., E.RICO & M.M.MART.ORT. SP. NOV. Diagnosis: A propiore specie, F. desertorum, differt propter externis receptacularibus paleis glabris ad subglabris in abaxialis faciei tergo exhibere et pyramidalia capitula cum quinque angulis fortiter notatis. También es necesario considerar que F. desertorum s.s. presenta un gran nivel de polimorfismo genético entre las muestras incluidas en nuestro estudio. Esto se puede deber a que tiene un área de distribución muy extensa (Wagenitz 1968, 1969) y que quizá, las muestras seleccionadas para el estudio constituyen una representación sesgada (Tunisia, Algeria and the Canary Islands) del rango geográfico de la especie, a que en su historia evolutiva han existido episodios de reticulación ancestral (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2013b), o a que existe la posibilidad de que se puedan descubrir nuevos taxones entre la variabilidad de F. desertorum s.s. Es necesario plantear nuevos análisis con un mayor muestreo para obtener una explicación satisfactoria de estas cuestiones.   V. Filago longilanata and F. prolifera (Gnaphalieae: Asteraceae): Two neglected species from the Filago desertorum clade rediscovered. Plant Biosyst., under review. Algunas especies pertenecientes a Filago han sido obviadas en ocasiones debido a problemas con su identificación, causados principalmente por la carencia de claros caracteres diagnósticos, su pequeño tamaño, y el corto ciclo de vida característicos de estas plantas. Un ejemplo de esta situación es el caso de dos especies endémicas del NO de África: F. longilanata (Maire & Wilczek) Greuter y F. prolifera Pomel. Filago longilanata se distribuye en las regiones semidesérticas de Marruecos. Fue descrita por Maire y Wilczek en 1934 como Evax longilanata Maire & Wilczek. Maire y Wilczek (Maire, 1934) reconocieron esta especie sobre la base del indumento lanoso de la planta, el vilano nulo, y la disposición helicoidal de las paleas. Después de estos autores esta especie ha sido mencionada en pocas bases de datos de flora y floras nacionales o regionales (Emberger and Maire 1941; Fennane and Ibn Tattou 1998; Greuter 2006+, 2008; El Oualidi et al. 2012; Ibn Tattou 2014; African Plant Database 2017, continuously updated), pero siempre basadas en el material tipo conservado en el herbario MPU. Sin embargo, Filago longilanata no ha sido incluida en la mayoría de los tratamientos taxonómicos propuestos para el género Filago (v.gr., Chrtek and Holub, 1963; Wagenitz, 1969; Andrés-Sánchez et al., 2011). Solamente Anderberg (1991a) consideró esta especie en su revisión de la tribu Gnaphalieae, y fue el primero en sugerir su transferencia de Evax Gaertn. a Filago. Filago prolifera fue descrito en 1874 por Pomel a partir de material de Algeria (Oued Mehaïguene y Metlili, provincia de Ghardaï). Para ello se basó en la forma y la disposición de las paleas, el número de flores del capítulo, y la forma de crecimiento. De acuerdo con Greuter (2006+, 2008) F. prolifera se distribuye en Túnez, Algeria y Marruecos. Aunque a diferencia de F. longilanata, muchos autores han incluido F. prolifera en catálogos florísticos, floras locales y/o regionales y revisiones taxonómicas, la mayoría del material disponible de esta especies está depositado en MA, MPU, P y WU y fue recolectado entre 1874 y 1933. Las similitudes morfológicas entre F. longilanata y F. crocidion (Pomel) Chrtek & Holub (v.gr., 15-20 paleas dispuestas helicoidalmente, vilano nulo), así como el similar área de distribución de ambos taxones, apoyan la hipótesis de que F. longilanata puede ser un miembro de F. subgen. Crocidion (Galbany-Casals et al., 2010). Por otra parte, F. prolifera tiene características morfológicas compartidas con F. pyramidata L. (v.gr., paleas dispuestas en filas, preferencias ecológicas similares), especie perteneciente a Filago L. subgen. Filago (Galbany-Casals et al., 2010). No obstante, las afinidades filogenéticas de ambas especies aún no han sido comprobadas. El objetivo de este trabajo es explorar las afinidades filogenéticas de las especies F. longilanata y F. prolifera dentro del género Filago. También se presentan descripciones completas de ambas especies, junto con un tratamiento nomenclatural, las primeras iconografías para ambos taxones así como una revisión corológica (se añaden nuevas localidades a las anteriormente conocidas), y una clave de identificación que incluye las especies más próximas. Sé seleccionaron cinco muestras de F. longilanata y cinco de F. prolifera (provenientes de dos y tres poblaciones respectivamente), recolectadas en Marruecos en Abril de 2015. Se incluyó de manera adicional dos muestras de F. desertorum y una de F. pyramidata recolectadas en simpatría con los especímenes estudiados de F. longilanata y F. prolifera, con el objetivo de comprobar la independencia genética de dichas muestras. Se amplificaron y posteriormente se secuenciaron las regiones espaciadoras ETS e ITS del ADN ribosómico nuclear en las muestras seleccionadas. El muestreo se completó con secuencias disponibles (especies correspondientes al FLAG clade) obtenidas de Galbany-Casals et al. (2010) y Andrés-Sánchez et al. (2015). Se realizaron análisis filogenéticos de las secuencias seleccionadas mediante máxima parsimonia (MP) e inferencia bayesiana (BA). El análisis de las regiones ETS e ITS recuperan los mismos clados que los obtenidos por autores anteriores (Galbany-Casals et al., 2010). Las muestras secuenciadas de novo se posicionaron en dos clados diferentes dentro de F. subgen. Filago. Los ejemplares correspondientes a F. longilanata, F. prolifera y F. desertorum se recuperan en el “Filago desertorum clade”. Las muestra de F. pyramidata se sitúan en otro clado (Clade I en Galbany-Casals et al., 2010), en una politomía junto a F. pyramidata, F. micropodioides Lange, F. duriaei Coss. ex Lange, F. congesta Guss ex DC., F. fuscescens Pomel y F. inexpectata Wagenitz, con F. ramosissima Lange como grupo hermano. Se aprecia un cierto grado de variabilidad intraespecífica entre las muestras de F. longilanta y F. prolifera dentro del “Filago desertorum clade”, dentro del cual se recupera una politomía de cuatro grupos: el primer grupo incluye casi todas las muestras de F. longilanata; el segundo está formado por las muestras de F. prolifera (excepto F. prolifera 5) y F. longilanata 5; el tercero incluye F. desertorum, F. mareotica y F. prolifera 5; el último grupo se corresponde con F. castroviejoi. Tras realizar una revisión de ca. 3500 especímenes de Filago depositados en 26 herbarios, tan solo se ha encontrado un pliego de F. longilanata, a parte del ejemplar tipo incluido en MPU. Este ejemplar está depositado en BM y había sido incorrectamente identificado como Bombycilaena discolor (Pers.) M.Laínz: MOROCCO: Souss-Massa-Drâa (Agadir); Ourzazate to Ksar-es-Souk, 20 km along track to Bou Skour from Skoura, 30.999975°, -6.499994°, 1350 m., 18-VI-1974, 823 Reading University/B.M. Expedition (BM). La inclusión de las especies F. longilanta y F. prolifera dentro del “Filago desertorum clade” incrementa la heterogeneidad morfológica del grupo. Sus miembros tan solo se caracterizan por estar distribuidos en ambientes xerofíticos (halofíticos en el caso de F. mareotia), y solo tienen un carácter morfológico en común: aquenios cubiertos por pelos cortos clavados formados por dos células (short clavate twin hairs). No obstante, este carácter se trata de una simplesiomorfía, ya que el carácter esta compartido con otras especies del género. Es sencillo identificar F. longilanata del resto de especies del “Filago desertorum clade” sobre la base de caracteres morfológicos. Filago longilanata tiene de 15-20 paleas receptaculares dispuestas helioidalmente y el vilano nulo, mientras que el resto de especies del clado tienen de 15-20 a 25-30 paleas receptaculares dispuestas en filas y tienen vilano. La disposición helicoidal de las paleas receptaculares es una sinapormorfía del género Evax. Todas las especies incluidas en ese género se consideran actualmente en Filago. En el caso de F. prolifera, su diferenciación dentro de clado se basa en el número de paleas receptaculares; mientras que F. prolifera tiene 4 paleas receptaculares por fila (20 paleas), las especies consideras dentro de “Filago desertorum clade” tienen las paleas dispuestas en 5-6 filas verticales (25-30 paleas). Además, F. prolifera tiene un tipo de crecimiento muy característico: desde un glomérulo acaule crecen muchas ramas lateras decumbentes, a forma de pleocasio, las cuales sostienen un glomérulo en su ápice (excepcionalmente 2); mientras que el resto de especies del clado tienen un desarrollo del tallo diferente, como un dicasio, monocasio o pleocasio. Finalmente, F. prolifera tiene las hojas estrechadas en la base, a modo de peciolo, mientras que en F. castroviejoi, F. desertorum y F. mareotica son sésiles. Filago longilanata y F. prolifera comparten parte del área de distribución con el resto de especies incluidas en el “Filago desertorum clade”. Mientras que F. longilanata (Marruecos) y F. prolifera (Marruecos, Algeria y Túnez) son los únicos taxones endémicos del NO de África, el resto de especies muestra una distribución más amplia que incluye otras regiones y países: F. castroviejoi SE de España y NO de Marruecos; F. mareotica SE de España, Chipre, Algeria, Túnez, Libia y Egipto; y F. desertorum todo el N de África desde las Islas Canarias a Egipto, SE de Asia y SE de España.   VI. SSR Markers for Filago subgen. Filago (Gnaphalieae: Asteraceae) and cross-amplification in three other subgenera. Appl. Plant. Sci., under review. El género Filago L. (Ateraceae: Gnaphalieae) incluye ca. 45 especies agrupadas en cuatro subgéneros (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2011). Las especies que lo integran se caracterizan por ser plantas anuales de ciclo corto, con preferencia por zonas secas y alteradas, aunque algunas especies tienen requerimientos ecológicos más restringidos como los de las especies que medran en salinas o en cubetas de alta montaña. Muchas de estas plantas son consideradas malas hierbas de cultivo (Carretero, 2004; Randall, 2007) y otras se encuentran incluidas en listas nacionales y/o regionales de especies amenazadas (Barreno et al., 1985; Moreno, 2008), debido a su área de distribución (Andrés-Sánchez et al., 2013a). Ocho de las especies actualmente consideradas dentro de Filago, han estado incluidas tradicionalmente en el género Evax Gaertn. Estas ocho especies constituyen un grupo monofilético (en adelante Evax group) que actualmente se encuentra incluido dentro de F. subgen. Filago (Andrés-Sánchez et al., 2015). Las relaciones filogenéticas entre los integrantes de este clado no están resueltas, debido a la baja resolución a este nivel de estudio que tienen los marcadores moleculares basados en secuencias del ADN ribosómico nuclear y ADN plastidial (Galbany-Casals et al., 2010). El número de cromosomas más frecuente en el género Filago es de 2n = 28 y, excepcionalmente 2n = 26 (Watanabe, 2012). El tamaño del genoma para estas especies es sorprendentemente pequeño (Andrés-Sánchez et al., 2013b). Según varios autores (Labani & Elkington, 1987; Albach & Greilhuber, 2004) los valores bajos de tamaño del genoma están relacionados con ciclos de vida cortos y con la autogamia. Las especies incluidas en Filago han sido consideradas tradicionalmente autogamas estrictas o geitonogamas (Wagenitz, 1965). No obstante, en el caso del Evax group, los granos de polen probablemente van desde las flores internas hermafroditas aunque funcionalmente masculinas hacia las flores externas, que son femeninas, descartándose la autogamia estricta. Hemos elegido para desarrollar los microsatélites un pequeño clado dentro del Evax group, el cual incluye las siguientes especies: F. carpetana (Lange) Chrtek & Holub, F. lusitanica (Samp.) P.Silva y F. gaditana (Pau) Andrés-Sánchez & Galbany. Estas especies tienen un área de distribución disjunta, la cual está restringida a la Península Ibérica y al NO de África. Dado que la autogamia s.l. ha sido frecuentemente relacionada con eventos de dispersión y colonización a larga distancia (Obbard et al., 2006), estas especies pueden constituir un grupo de estudio interesante para desarrollar trabajo de biogeografía en el Mediterráneo occidental con plantas anuales (v.gr., dispersión a larga distancia y autogamia; efectos de la ausencia de mecanismos de dispersión; etc). Además, el desarrollo de un marcador codominante para el grupo permitiría obtener datos detallados acerca del flujo genético y del impacto de la autogamia. También es necesario obtener marcadores hipervariables para el grupo, ya que trabajos anteriores han demostrado la falta de resolución de los marcadores convencionales basados en la secuenciación de regiones del ADN nuclear y plastidial (Galbany-Casals et al., 2010; Andrés-Sánchez et al., 2015). Asegurar la transferibilidad de estos marcadores ayudaría a desarrollar futuros estudios acerca de las relaciones filogenéticas existentes dentro del grupo. Se seleccionó material desecado de 11 recolecciones de F. carpetana y F. gaditana y, se extrajo el ADN total para la preparación de la librería de microsatelites. La librería fue preparada por Genoscreen (Lille, Francia) usando un secuenciador 454-GS-FLX (Roche Diagnostics, Meylan, France) (Malausa et al., 2011). Se fragmentó el ADN total obtenido y se enriqueció con los siguientes motivos: TG, TC, AAC, AAG, AGG, ACG, ACAT y ACTC. Se obtuvieron un total de 25692 secuencias. Se analizaron las secuencias obtenidas con el programa QDD2 (Meglécz et al., 2014), de las cuales se cribaron 3160 secuencias con motivos de tipo microsatélite. Se seleccionaron 30 cebadores a los cuales el programa había otorgado bajos niveles de penalización entre los 63 catalogados como “A design” (Meglécz et al., 2014). Se encargó la síntesis de los cebadores seleccionados (Eurofins, Ebersberg, Germany) y se comprobó la variabilidad de los loci para los que amplificaban en dos muestras de F. lusitanica, dos de F. carpetana y dos de F. lusitanica. Se examinaron las secuencias obtenidas para asegurar la homología de las mismas y su correcta amplificación. Se seleccionaron dieciséis pares de cebadores y se usaron para amplificar tres poblaciones de 30 individuos de F. carpetana, F. gaditana y F. lusitanica. Se añadió al cebador forward la secuencia universal M13(-21) 5´-TGTAAAACGACGGCCAGT-3´ (Schuelke, 2000) y se marcaron las secuencias amplificadas con los fluorocromos 5-FAM, VIC, NED or PET. Se analizó el producto de PCR por secuenciación capilar en un modelo ABI 3730 Capillary Sequencer (Life Technologies) y se usó como estándar GeneScan 500 LIZ size (Life Technologies). Se analizaron los electroferogramas con el programa GenMarker AFLP/Genotyping versión 1.8. (SoftGenetics, State College, Pennsylvania, USA). Se descartaron seis cebadores debido a que amplificaban loci monomórficos para todas las especies. Se amplificaron y enviaron a secuenciar las muestras con tamaños no esperados, para comprobar la presencia de indels o mutaciones. Se usaron tres poblaciones correspondientes a tres especies de Filago (F. carpetana, F. gaditana and F. lusitanica) para obtener parámetros de genética de poblaciones. El número de alelos obtenidos varió de uno a tres, dos a seis y dos a siete en las poblaciones de F. lusitanica, F. gaditana y F. carpetana respectivamente. Solo se detectaron alelos monomorficos en la población de F. lusitanica para los loci mf5, mf8, mf9, mf10, mf19 y mf28. Se detectó una desviación en el HWE (P<0.01) en todas las poblaciones analizadas y para todos los loci excepto en el caso de F. carpetana y F. gaditana para el locus mf25. Después del ajuste de Bonferroni se realizó una comparación por pares y los resultaros arrojaron que existía desequilibrio de ligamiento con un valor significativo en todos los casos, excepto para aquellos en los que estaban implicados mf5 y mf9. Se comprobó la transferibilidad de los marcadores desarrollados en otras 8 especies del género (tres muestras por especie) representativas de los restantes tres subgéneros que comprenden Filago sensu Galbany-Casals et al. (2010). Se aseguró la transferibilidad de los nuevos marcadores excepto para mf10. El desarrollo de protocoles de PCR más específicos puede mejorar estos resultados. Se presenta por primera vez una serie de cebadores de regiones microsatélite polimórficas para el género Filago. Estos nuevos marcadores ayudarán en futuros estudio en el género tras la optimización de los protocolos de PCR. Esta nueva herramienta contribuye al desarrollo de futuros estudios filogenéticos, filogeográficos y de genética de poblaciones, los cuales pueden contribuir con información valiosa para ampliar el conocimiento en el género Filago y para promover la conservación de las especies que lo integran.   VII. Conclusiones 1. Se confirma la monofília del Inula complex dentro del grupo natural Inuleae-Inulinae, así como el estatus parafilético de los géneros Chrysophthalmum Schp. Bip., Inula L. y Pentanema Cass. en su circunscripción tradicional, mediante un análisis filogenético basado en secuencias de ADN nuclear y plastidial. 2. Según los datos obtenidos, el género Inula se recupera en dos linajes independientes. El primer linaje está formando por Inula helenium L. -la especie tipo del género- que se agrupa en un clado junto con Telekia speciosa Baumg. y otros representantes asiáticos y africanos de Inula. El segundo linaje está formado por el resto de especies de Inula euroasiáticas, que son recuperadas junto con Pentanema divaricatum Cass. –la especie tipo del género Pentanema- en una posición más cercana al resto de géneros del Inula complex (i.e., Chrysophthalmum, Carpesium L., Rantheriopsis Rauschert). 3. Sobre la base de los resultados de los análisis filogenéticos basados en secuencias de ADN y de los datos morfológicos obtenidos, se propone una nueva circunscripción para los géneros Inula y Pentanema, con el fin de obtener una clasificación basada en géneros monofiléticos. 4. Como consecuencia de la nueva delimitación de Inula y Pentanema y para preservar la monofilia de los géneros que componen el Inula complex, se proponen 22 nuevas combinaciones en Pentanema, una en Monactinocephalus Klatt y una en Vicoa Cass. Además, se recuperan los nombres Codonocephalum peacockianum Aitch. & Hemsl., Codonocephalum grande (Schrenk ex Fisch. & C.A.Mey.) B.Fedtsch., Monactinocephalus paniculatus Klatt y Vicoa indica (L.) DC. 5. Se ha llevado a cabo un análisis de variabilidad y estructuración genética que incluye varias poblaciones de las especies de Pentanema incluidas en el “Pentanema conyzae clade”, distribuidas en el Mediterráneo Occidental, utilizando un marcador hipervariable de huella genética tipo AFLP. Los datos obtenidos y tratados con métodos fenéticos y de análisis bayesiano de estructuración genética recuperan siete grupos que se corresponden con las siete especies bien establecidas tradicionalmente. 6. El análisis de fragmentos AFLP indican que en la formación de las especies de Pentanema distribuidas en el Mediterráneo Occidental han intervenido procesos de evolución reticulada. Así, los resultados sugieren que en el origen de las especies P. langeanum (Beck) D.Gut.Larr., M.Santos-Vicente, Anderb., E.Rico & M.M.Mart.Ort y P. maletii (Maire) D.Gut.Larr. et al. podrían estar implicados eventos de hibridación, de modo que ambas especies pueden ser consideradas alopoliploides. 7. Se confirma la presencia de P. britannicum (L.) D.Gut.Larr. et al. en la Península Ibérica y se aporta un nuevo paso de clave útil para distinguir P. britannicum de P. helenioides (DC.) D.Gut.Larr. et al., dos especies que han sido frecuentemente confundidas entre sí. Además, tanto los datos morfológicos, como los derivados del análisis de AFLPs, sugieren el posible origen híbrido entre ambas especies de algunos ejemplares recolectados en una localidad de la Península Ibérica, lo que demuestra por primera vez la posibilidad de hibridación entre estas especies y puede explicar, al menos en parte, las citadas confusiones. 8. Se ha realizado una revisión morfológica de los integrantes del “Filago desertorum clade” que ha permitido diferenciar dos morfotipos dentro de la variabilidad de F. desertorum Pomel s.l., ambos con pelos en el margen de las paleas receptaculares internas. El primero –F. desertorum s.s.– tiene las paleas receptaculares externas vilosas-tomentosas, el capítulo ovado con cinco ángulos poco marcados, y se distribuye desde las Islas Canarias hasta Oriente próximo, exceptuando el norte del Atlas. El segundo –morfotipo castroviejoi- muestra las paleas receptaculares externas de glabras a subglabras, el capítulo piramidal con cinco ángulos fuertemente marcados, y se distribuye en el SE de la Península Ibérica y el NO de Marruecos. 9. A fin de complementar el trabajo anterior, se ha efectuado un estudio de estructuración de la variabilidad genética basado en marcadores AFLP en el “Filago desertorum clade”. Ello ha permitido reconocer tres entidades diferenciadas. Una de ellas se corresponde con muestras identificadas como F. mareotica Delile, otra con individuos correspondientes al morfotipo F. desertorum s.s. y la tercera con el morfotipo castroviejoi. 10. Se concluye, sobre la base de los datos morfológicos y moleculares, que el morfotipo castroviejoi debe ser reconocido como una entidad taxonómica independiente de F. desertorum. De acuerdo con ello se ha descrito la nueva especie Filago castroviejoi Andrés-Sánchez, D.Gut.Larr., E.Rico & M.M.Mart.Ort. sp. nov. 11. Se aporta un tratamiento taxonómico para F. castroviejoi, F. desertorum y F. mareotica, que incluye una clave de identificación y una revisión nomenclatural completa, en el que, además, se tipifican cuatro nombres (F. spathulata var. alexandrina, F. sphatulata f. evaciformis, Gifolaria floribunda y F. mareotica var. murcica). 12. Se ha explorado la posición filogenética dentro del género Filago de dos especies distribuidas en el Norte de África, poco conocidas, y no incluidas en análisis moleculares anteriores, Filago longilanata (Maire & Wilczek) Greuter y Filago prolifera Pomel, mediante el análisis de secuencias del ADN ribosómico nuclear y plastidial. Según los resultados obtenidos, ambas especies se encuadran en el “Filago desertorum clade”. 13. Se aportan descripciones completas para F. longilanata y F. prolifera, junto con un tratamiento nomenclatural, las primeras iconografías de dichas especies y mapas de distribución de nueva elaboración, que incluyen localidades en las que crecen estas plantas que previamente no eran conocidas. 14. Se han descrito y optimizado nuevos marcadores moleculares con suficiente resolución como para poder desentrañar en el futuro las relaciones filogenéticas existentes entre los grupos que componen Filago L. subgen. Filago. Se han desarrollado diez pares de cebadores correspondientes a regiones de tipo microsatélite para el género Filago en las especies F. lusitanica (Samp.) P.Silva, F. carpetana (Lange) Chrtek & Holub y F. gaditana (Pau) Andrés-Sánchez & Galbany, y se ha comprobado su transferibilidad en 24 muestras correspondientes a 8 especies representativas de los otros tres subgéneros de Filago BIBLIOGRADÍA CITADA AFRICAN PLANT DATABASE (version 4.3.9). Conservatoire et Jardin Botanique de la Ville de Genève and South African National Biodiversity Institute, Pretoria. “Retrieved [August 2017]”, from http://www.ville-ge.ch/musinfo/bd/cjb/africa/. ALBACH, D.C. & GREILHUBER, J. 2004. Genome size variation and evolution in Veronica. Ann. Bot. 94: 897—911. ANDERBERG, A.A. 1989. Phylogeny and reclassification of the tribe Inuleae (Asteraceae). Can. J. Bot. 67: 2277—2296. ANDERBERG, A.A. 1991a. Taxonomy and phylogeny of the tribe Gnaphalieae (Asteraceae). Opera Bot. 104: 5—195. ANDERBERG, A.A. 1991b. 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