Metabolic adaptations of neurons to physiological oxygen concentrations

Zusammenfassung

Tradicionalmente, los cultivos primarios de células nerviosas se han realizado en condiciones ambientales estándar, típicas de la mayoría de los cultivos celulares, esto es: temperatura de 37ºC y presiones parciales de oxígeno (pO2) y de CO2 (pCO2) de 21% y 5% respectivamente. Sin embargo, la pO2 utilizada en los cultivos está lejos de los niveles fisiológicos, que oscilan entre el 1% y el 10% dependiendo de la distancia de las células a los capilares sanguíneos. Dada la relación directa que existe entre las disponibilidades de oxígeno y el metabolismo oxidativo celular, creemos que el cambio de los niveles estándar de oxigeno hacia los niveles más fisiológicos (pO2 entre el 1% al 10%), para establecer las condiciones basales del cultivo, puede condicionar la respuesta a las alteraciones que reflejen estados patológicos y que puedan usarse como modelos. Por otro lado, la presencia de los astrocitos en estas condiciones, igualmente puede modular dicha respuesta aproximando los resultados del estudio a una situación más cercana a la fisiológica y, por tanto, más adecuada para la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Esta tesis (i) caracterizó el fenotipo de neuronas y astrocitos a cultivados a diferentes presiones parciales de oxígeno, y ha definido la pO2 del 5% como la más próxima a la condición fisiológica de oxígeno y por lo tanto la optima para realizar cultivos primarios de neuronas y astrocitos; (ii) ha evaluado el metabolismo oxidativo en la condición fisiológica de oxígeno en comparación con la sobre-oxigenación de la condición estándar usada tradicionalmente en los cultivos; (iii) ha estudiado la influencia de astrocitos en co-cultivo sobre los cambios observados en el metabolismo oxidativo de neuronas y en las condiciones anteriores; (iv) ha investigado los cambios que se produzcan en la estructura y el comportamiento mitocondrial en condiciones fisiológicas de oxígeno. De este trabajo se sacaron las siguientes conclusiones: 1. La presión parcial fisiológica de oxígeno (o pO2) del 5% mejora la supervivencia de neuronas y astrocitos en cultivo primario, reduce el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) en las neuronas (pero no en los astrocitos) e induce la producción de mROS en los astrocitos (pero no en las neuronas). 2. La pO2 fisiológica del 5% induce en astrocitos un aumento en las formas elongada e interconectada de las mitocondrias acompañada de una reducción en la anchura y un aumento en el número y densidad de las crestas mitocondriales, mientras que las neuronas mantuvieron la forma fragmentada como forma dominante. Además, en estas condiciones, aumentó la expresión de la proteína reguladora de la fusión mitocondrial OPA1 en astrocitos y se modificó su patrón de isoformas en las neuronas, con un aumento de las isoformas c, d y e, y una reducción de las isoformas a y b. 3. La pO2 fisiológica del 5% reduce la expresión de los RNA mensajeros relacionados con la Cadena Transportadora de Electrones y la Fosforilación Oxidativa, en neuronas y astrocitos. 4. Las neuronas co-cultivadas con astrocitos a una pO2 fisiológica del 5% presentan una mayor cantidad de Complejo I libre, lo que resulta en un aumento en la producción de mROS en estas células. Al mismo tiempo, se redujo la banda F1 asociada al Complejo V (ATP sintasa) y se produjo un cambio de altura en la banda del Complejo IV. La muerte neuronal observada a la pO2 fisiológica se redujo aún más por la presencia de astrocitos. En estas condiciones, solo los astrocitos revertieron su potencial de membrana mitocondrial mediante una significativa despolarización. 5. La pO2 fisiológica del 5% estimuló el metabolismo glucídico, lo que se pone de manifiesto por el consumo incrementado de glucosa y la liberación de lactato en neuronas, astrocitos y neuronas co-cultivadas. La glucolisis resultó aumentada en astrocitos, neuronas y neuronas co-cultivadas, pero no en astrocitos co-cultivados. Estos cambios en el metabolismo glucídico no parecen estar mediados por el factor HIF1a ya que, en estas condiciones, se redujo tanto su presencia en el núcleo como su actividad. 6. A una pO2 fisiológica del 5%, la Vía de las Pentosas Fosfato resultó reducida, a juzgar por la reducción observada en la mayoría de los mRNAs transcritos de dicha vía en las neuronas co-cultivadas. 7. Mientras la producción de anión superóxido (O2·-) aumentó sustancialmente en las neuronas co-cultivadas bajo condiciones de pO2 fisiológica, la producción de H2O2 fue significativamente reducida. Esto es muy probablemente debido a la disminución de la expresión de la proteína SOD2 mitocondrial. 8. La pO2 fisiológica del 5% lleva a las neuronas co-cultivadas hacia la madurez mediante la reversión de las fases S y G0/G1 del ciclo celular. En general nuestros resultados muestran que bajo una pO2 del 5%, compatible con las concentraciones de O2 encontradas en el tejido “in vivo” y en estrecha proximidad con los astrocitos, reflejando su situación natural, las neuronas sufren una dramática adaptación metabólica y de su estado redox que es muy diferente de la observada con valores estándar y no fisiológicos de pO2 (21%). En general, estas adaptaciones son responsables de una situación más saludable para las células, a juzgar por la fisiología mitocondrial, incluyendo la formación de ROS, los cambios en el potencial de membrana mitocondrial Δψm, así como el grado de supervivencia. Nuestros datos igualmente revelan que hay una comunicación metabólica astrocito-neurona altamente activa, que contribuye al fenotipo metabólico de las neuronas. Así, se debe tener cuidado al trasladar la caracterización metabólica de las neuronas desde las condiciones de cultivo a las condiciones fisiológicas.