Clonación y caracterización de los genes tardíos involucrados en la ruta biosintética del ácido clavárico, un anticancerígeno producido por Hypholoma sublateritium

Resum

Se ha desarrollado y optimizado una estrategia efectiva de transformación para H. sublateritium, mediada por A. tumefaciens. Se ha demostrado la importancia de utilizar secuencias promotoras pertenecientes, al menos, a la misma Subdivisión (Basidiomycotina) para transformar eficientemente especies del género Hypholoma. Se ha observado una fuerte relación entre el pH del medio de cultivo y la producción de ácido clavárico en los distintos medios de cultivo ensayados. También se ha observado la influencia de distintos factores sobre la producción de ácido clavárico, como son la adición de cobre, la agitación del cultivo o la suplementación con aceite. Se han identificado en el genoma de la cepa HS898 de H. sublateritium dos genes que codifican para enzimas muy importantes en la biosíntesis de esteroles y ácido clavárico, erg1 y osc1; estos genes fueron clonados y secuenciados. El gen erg1 de 1659 pb, codifica para una proteína de 461 aminoácidos con una masa molecular deducida de 49,079 kDa. La proteína codificada por dicho gen, presenta las regiones conservadas de unión a FAD características de algunas monooxigenasas. La sobreexpresión del gen erg1, conlleva un incremento en la producción de ácido clavárico acorde con el aumento en la dosis génica aunque también aumenta el crecimiento del micelio. La atenuación del gen erg1 genera un fenotipo típico dependiente de ergosterol (los transformantes sólo crecen si al medio de cultivo se añade ergosterol), lo que sugiere que el gen erg1 posiblemente esté involucrado en el metabolismo primario de H. sublateritium, y también en el metabolismo secundario, ya que disminuye la producción de ácido clavárico. El gen osc1 de 2840 pb, codifica para una proteína de 721 aminoácidos con una masa molecular deducida de 82,388 kDa. La proteína codificada por dicho gen, presenta las regiones conservadas "QW" características de la mayoría de las terpenociclasas. La sobreexpresión del gen osc1, co