Biosíntesis de poli-hidroxialcanoatos en "Pseudomonas putida U"análisis genético y funcional de los elementos implicados en la estabilización intracelular del gránulo

Resum

En el desarrollo de los trabajos para la elaboración de la presente Tesis Doctoral, se completó la secuenciación del locus pha de P. putida U. Este locus tiene una extensión de 7.000 pb y contiene 6 genes (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF y phaI). Se identificaron tres regiones de DNA con actividad promotora. Estos promotores gobiernan la expresión de los genes de este locus. La deleción completa del locus pha en P. putida U nos permitió obtener un mutante incapacitado para acumular polímero tanto a partir de precursores alifáticos como aromáticos. En este mutante, la expresión tn trans del gen phaC1 (que codifica la actividad polimerasa) da lugar a la acumulación intracelular de polímero. No obstante, la acumulación tiene lugar siguiendo un patrón (caracterizado por la aparición de un elevado número de gránulos de pequeño tamaño) claramente diferenciado del de la cepa silvestre. Este hecho nos indica que, si bien es posible la acumulación de polímero únicamente con la expresión del gen phaC1, sería necesario el concurso de otros factores para que la acumulación tenga lugar según el modelo propio de la cepa silvestre (pocos gránulos de gran tamaño). Sobre la cepa delecionada en el locus pha en la que se expresa el gen phaC1, se clonaron los genes phaD, phaF, phaI y combinaciones de ellos, utilizando otro plásmido compatible. La expresión de phaF (solo o en combinación con phaD) da lugar a la aparición de unos gránulos similares en número y tamaño a los de la cepa silvestre. Este hecho sugiere que el producto del gen phaF desempeña un papel fundamental en el establecimiento de la arquitectura molecular del gránulo; posiblemente dirigiendo y/o controlando los mecanismos que desencadenan la coalescencia de los gránulos incipientes para generar el gránulo maduro, con la consiguiente disposición y estabilización intracelular del material polimérico. sin embargo, la expresión conjunta de los genes phaI