Evaluación de la fermentación y la microbiota ruminal promovidas por dietas convencionales y no convencionales en caprino y en sistemas in vitro

Resumen

En este trabajo se estudian diversos aspectos de interés en nutrición de rumiantes: i) la variabilidad en la microbiota ruminal entre animales; ii) la capacidad de simulación de la microbiota ruminal en diferentes sistemas in vitro; iii) el potencial de destríos de invernadero como alimentos alternativos a la cebada en dietas para caprino. El primer aspecto se abordó mediante el experimento 1, el cual se llevó a cabo para determinar la variabilidad de las poblaciones bacterianas entre distintos animales de la misma especie y raza así como la persistencia de esta variabilidad tras introducir contenido ruminal de otro animal. El ensayo se realizó con cabras de un mismo rebaño. Mediante T-RFLP se estudiaron las diferencias en la estructura de las poblaciones bacterianas de los distintos animales antes y después de llevar a cabo un intercambio de parte del contenido ruminal entre ellos. Los resultados del análisis cluster mostraron que, en términos de estructura bacteriana, las muestras de contenido ruminal del mismo animal siempre se agrupaban entre sí, independientemente del día y momento del muestreo. Esto es indicio de que existen marcadas diferencias en la composición bacteriana ruminal entre animales. Además, puesto que estas diferencias persisten tras la introducción de microorganismos de otro animal, se puede concluir que las poblaciones bacterianas indígenas de un animal son muy resistentes a ser desplazadas por las de otros individuos. El segundo aspecto de este trabajo se abordó en los experimentos 2, 3, 4 y 5. Los experimentos 3, 4 y 5 también se realizaron para abordar el tercer aspecto mencionado anteriormente. El experimento 2 se llevó a cabo para estudiar los cambios provocados en las abundancias de varios grupos microbianos (bacterias totales, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, hongos y arqueas metanogénicas), por un lado, y en la diversidad y estructura bacterianas, por otro lado, como consecuencia de la preparación del inóculo ruminal y la adaptación a la dieta en fermentadores de flujo continuo simple (FFCS). Las dietas empleadas en este experimento estaban basadas en heno de alfalfa y concentrado en 2 proporciones (70:30, dieta LC, y 30:70, dieta HC). La duración de las incubaciones en los fermentadores fue de 7 días. Los resultados de este experimento mostraron que las densidades de todos los grupos microbianos considerados eran inferiores en el contenido de los fermentadores que en el contenido del rumen. Aunque no se observaron diferencias en la diversidad bacteriana entre rumen y fermentadores, sí se detectaron divergencias en la composición bacteriana de ambos ecosistemas. Estos resultados indican que, puesto que la extracción y procesado del contenido ruminal previos a su inoculación en los fermentadores supone una pérdida importante de biomasa microbiana, habría de reconsiderarse el protocolo de preparación del inóculo ruminal para incluir cierta cantidad de sólidos o modificar el momento de la toma del contenido ruminal. Por otro lado, a lo largo de la incubación en fermentadores, no se observaron cambios en las abundancias microbianas, diversidad o estructuras bacterianas lo que indica que el tiempo de adaptación del sistema podría ser inferior al establecido como óptimo (7 días) para estudios en FFCS, que utilizan dietas similares a las que toman los animales. La relación forraje:concentrado en dietas basadas en heno de alfalfa no tuvo ningún efecto sobre las abundancias microbianas, diversidad o estructura bacterianas en los FFCS. El experimento 3 consistió en una incubación, en el sistema digestor DaisyII de ANKOM, de los ingredientes de las dietas utilizadas en los experimentos 4 y 5 (cebada, paja de trigo, harina de salvado de trigo, torta de girasol, heno de alfalfa, tomate y pepino) para determinar sus digestibilidades, siguiendo el procedimiento descrito por Tilley y Terry (1963). Las muestras se incubaban durante 48 horas en una mezcla de contenido ruminal filtrado y saliva artificial de McDougall (1948). El experimento 4 consistió en 3 incubaciones, de 72 horas de duración cada una, en un sistema de cultivos no renovados de microorganismos ruminales, de una dieta control y 15 dietas experimentales en las que la cebada se reemplazaba por cantidades crecientes de destríos de tomate, pepino o una mezcla (1:1) de ambos tipos de destríos. El inóculo empleado consistía en una mezcla de contenido ruminal filtrado y una disolución mineral y tamponadora (Goering y van Soest, 1970). Se midieron la presión y el volumen de gas producido en los frascos a intervalos regulares y se analizaron diversos parámetros de la fermentación (pH, AGVs, amonio) y la composición de los residuos, tras 24 horas de incubación. Los resultados de la fermentación microbiana y la producción de gas en el experimento 4 mostraron que ni el tipo de destrío ni su cantidad en la dieta afectaban al pH, la producción de gas o los parámetros de la cinética de producción del mismo (velocidad y producción potencial máxima), la concentración de amonio, la producción de AGVs o las proporciones molares de la mayoría de los AGVs. La ausencia de diferencias significativas, derivadas de la cantidad de cebada que se sustituía por los destríos, hizo que en el experimento 5 se optase por evaluar comparativamente la dieta control y aquellas que incluían los niveles más elevados de destríos de tomate, de pepino y de la mezcla tomate-pepino. Se llevaron a cabo 2 series de incubación utilizando FFCS, en los que se inoculaba líquido ruminal filtrado. Cada serie de incubación incluía un periodo de adaptación a las dietas de 4 días de duración y 3 días de recogida de alícuotas de los efluentes para determinar AGVs, amonio y nitrógeno total, así como la composición química de los efluentes y de los pellets bacterianos de los efluentes. En este experimento se observó que las dietas con tomate o pepino promovían valores de pH superiores a los alcanzados con la fermentación de las dietas control o de la que contenía ambos subproductos. La producción total de AGVs no se afectó por el tipo de dieta aunque sí lo hicieron las proporciones molares de la mayor parte de los AGVs determinados. Las proporciones molares de acético eran inferiores con aquellas dietas que incluían pepino o la mezcla tomate:pepino. La proporción de propiónico y la relación acético:propiónico eran menores y mayores, respectivamente, con las dietas que incluían tomate en comparación con el resto de las dietas estudiadas. Las proporciones molares de ácidos grasos ramificados fueron significativamente inferiores con las dietas que incluían destríos de invernadero, en comparación con la dieta control. La digestibilidad de la materia orgánica y de los carbohidratos, así como la eficiencia de producción de AGVs, o los parámetros relativos al metabolismo del N no se afectaban por la inclusión de los destríos en la dieta. Este trabajo representa la primera información comparada de la capacidad de diferentes sistemas in vitro para sustentar una microbiota que permita una simulación adecuada de la fermentación ruminal. En los experimentos 3, 4 y 5 se tomaron muestras del inóculo inicial y en diferentes momentos de la incubación, para analizar las abundancias de varias poblaciones microbianas (bacterias, hongos, F. succinogenes, R. flavefaciens, hongos, arqueas metanogénicas y protozoos), mediante RT-qPCR, así como la diversidad y estructura bacteriana, mediante T-RFLP. En el sistema de incubación DaisyII de ANKOM (experimento 3) se observó que las poblaciones de los organismos fibrolíticos (F. succinogenes, R. flavefaciens y hongos) experimentaban un considerable descenso, tras 48 horas de incubación. Sin embargo, la densidad de las bacterias y los protozoos disminuyó en menor medida o no lo hizo, respectivamente, mientras que la de las arqueas metanogénicas aumentó en ese mismo periodo de tiempo. En cultivos no renovados de microorganismos ruminales (CNRMR, experimento 4), las poblaciones de bacterias, protozoos y metanogénicos no cambiaron a lo largo de 24 horas de incubación, mientras que los microorganismos fibrolíticos aumentaron. Tras 72 horas de incubación, la abundancia de todos los microorganismos analizados disminuyó significativamente. La diversidad bacteriana y el número de especies se redujeron considerablemente, tanto en el sistema DaisyII como en los CNRMR, al final de la incubación. En FFCS (experimento 5), tras 4 días de incubación, la densidad de las bacterias totales no cambió pero disminuyó la de los protozoos y arqueas metanogénicas, con respecto a las encontradas en el inóculo original. Los organismos fibrolíticos aumentaron en ese periodo de tiempo. La composición en especies y la diversidad bacterianas eran muy similares en el inóculo ruminal, antes de iniciarse la incubación, y en los contenidos de los fermentares, tras 4 días de incubación. La abundancia de microorganismos fibrolíticos era menor en los efluentes, el 5º día de incubación, que en el contenido de los fermentadores pero no se observaron diferencias en la abundancia del resto de grupos microbianos así como en la diversidad y composición bacterianas. Estos resultados indicaron que: a) a pesar de la pérdida de numerosas especies bacterianas detectada en los CNRMR, estos sistemas in vitro pueden mantener la biomasa de los principales grupos microbianos, a las 24 horas de incubación, en niveles muy similares a los encontrados en el inóculo ruminal de partida; b) en FFCS, las abundancias bacterianas y de microorganismos fibrolíticos, así como la diversidad bacteriana encontradas muestran que este sistema de simulación in vitro mantiene un ecosistema muy similar al que existe en la fracción líquida del contenido ruminal; c) las abundancias de bacterias, protozoos y metanogénicos, así como la diversidad bacteriana encontradas en efluentes refuerzan su idoneidad para el estudio cualitativo y cuantitativo de determinados productos de la fermentación ruminal en estudios con FFCS. El bajo o nulo impacto de los destríos de invernadero (tomate y pepino), incorporados hasta en un 25% de la ración, sobre la fermentación, el metabolismo del nitrógeno, la biomasa microbiana y la diversidad bacteriana muestran el potencial de estos subproductos para ser empleados como sustitutos de la cebada en dietas para rumiantes.