Evaluación de ácidos siálico y gangliósidos en leche y preparados infantiles

Résumé

La leche materna es el alimento idóneo para satisfacer las necesidades del lactante, durante las primeras etapas de la vida. No obstante, en algunas situaciones se recurre a la alimentación con preparados infantiles, cuya composición en macronutrientes y oligoelementos esenciales (vitaminas y minerales) tiende a ser semejante a la de la leche humana. El ácido siálico y los gangliósidos son componentes bioactivos, presentes en leche que desempeñan un papel fundamental en distintos procesos de reconocimiento celular. Actualmente, con el fin de mejorar la composición de los preparados infantiles, se realizan investigaciones sobre componentes bioactivos esenciales, como ácido siálico y gangliósidos, cuyas cantidades y perfiles difieren entre la leche humana y los preparados infantiles. El objetivo general de esta tesis es conocer la composición en ácido siálico y gangliósidos de preparados infantiles comercializados y compararla con los presentes en leche humana, así como conocer la influencia de la utilización de concentrados proteicos de suero lácteo ricos en estos componentes en preparados infantiles. Para alcanzar este objetivo se ponen a punto y validan dos métodos de determinación de ácido siálico, uno que permite la cuantificación diferenciada de sus formas más abundantes (N-acetil y N-glicolil) por HPLC-fluorescencia y otro que permite la determinación de ácido siálico total por espectrofotmetría de absorción molecular. Atendiendo a los resultados obtenidos, los métodos validados se consideran idóneos para ser aplicados a preparados infantiles y leche humana. Los métodos validados se aplican a la determinación del ácido siálico y gangliósidos en preparados comerciales (para lactantes y de continuación), sueros lácteos a base de alfa-lactoalbúmina y membranas de glóbulos grasos de la leche ricos en ácido siálico y gangliósidos (utilizados en la elaboración de preparados experimentales que contienen estos ingredientes) y leche humana. Los resultados indican que el suero a base de membranas de glóbulos grasos de la leche presenta un mayor contenido de ácido siálico y gangliósidos que el de alfa-lactoalbúmina, con lo que los preparados elaborados con este ingrediente son los que presentan un mayor contenido de ambos componentes bioactivos, si bien sus contenidos son inferiores a los encontrados en la leche humana, y sus perfiles individuales difieren, excepto el perfil de gangliósidos del preparado de continuación experimental. A partir de los contenidos obtenidos de ácido siálico y gangliósidos, en los preparados para lactantes, se calculan sus ingestas diarias; estas no alcanzan las ingestas aportadas por la leche humana durante las primeras semanas de vida (20-30 mg/kg/día vs. 210 mg/kg/día). Se evalúa la bioaccesibilidad de ácido siálico y gangliósidos en la fracción soluble de preparados infantiles y leche humana obtenida tras una digestión gastrointestinal simulada en dos etapas (gástrica e intestinal). La etapa gástrica es la principal responsable de la reducción de la bioaccesibilidad de ambos compuestos, comprobándose que no es debido a una insolubilización de los mismos. En leche humana se obtiene la mayor bioaccesibilidad para el ácido siálico, seguida del preparado para lactantes y de continuación; mientras que en el caso de los gangliósidos el orden, de mayor a menor bioaccesibilidad, corresponde a preparado de continuación, leche humana y preparados para lactantes. Con el fin de iniciar estudios de biodisponibilidad se caracteriza el contenido y perfil de ácido siálico y gangliósidos en la línea celular Caco-2, células diferenciadas y no diferenciadas, evaluándose la citotoxicidad de los principales gangliósidos (GM3 y GD3) a las concentraciones halladas en las fracciones solubles de las muestras analizadas, mediante ensayos de viabilidad celular (azul tripán) e integridad mitocondrial (MTT), no observándose ningún efecto tóxico. Breast milk is the most suitable food in order to satisfy the needs of the unweaned baby at the earliest stage of its life. However, in some situations infant formulas are used instead, which is rich in macronutrients and essential oligoelements (vitamins and minerals) and is quite similar to human milk. Sialic acid and gangliosides are bioactive components found in milk and they have a fundamental role in different processes of cellular recognition. Nowadays, with the aim of improving the composition of infant formulas, research is performed on essential bioactive components, such as sialic acid and gangliosides, whose amounts and profiles differ from human milk and infant formulas. The main objective of this thesis is to identify the composition of sialic acid and gangliosides in manufactured infant formulas and to compare it with the ones found in human milk, and to discern the influence of the use of whey protein concentrates, rich in components found in infant formulas. In order to achieve this objective, two methods in the determination of sialic acid have been optimized and validated. One of the methods allows the distinctive quantification of its more abundant forms (N-acetyl and N-glycolil) by means of HPLC-fluorescence; the other method allows the determination of the complete sialic acid by means of molecular absorption spectrophotometry. According with the obtained results, the validated methods have been considered ideal in order to be applied to infant formulas and human milk. The validated methods are applied to the determination of sialic acid and gangliosides in manufacturated preparations (starter and follow-on formulas), whey made of alpha-lactalbumin and milk fat globule membranes rich in sialic acid and gangliosides (utilized in the production of experimental preparations containing these ingredients), and human milk. The results point out that the whey made of milk fat globule membranes presents a higher sialic acid and gangliosides content than the one consisting of alpha-lactalbumin. Therefore, the preparations made with this ingredient are the ones that present a higher content of both bioactive components. However, their contents are lower than the ones found in human milk and their individual profiles differ, except the profile of gangliosides in the experimental post breast-fed preparation. From the sialic acid and gangliosides contents obtained, in the starter formulas, daily ingestions are calculated; these do not achieve the ingestions provided by human milk during the first weeks of life (20-30 mg/kg/dya vs. 210 mg/kg/day). Evaluation of the bioaccessibility of sialic acid and gangliosides in the soluble fraction of child food and human milk is performed, both obtained after a two stage simulated gastrointestinal digestion (gastric and intestinal). The gastric stage is the main stage responsible for the reduction of the bioaccessibility of both compounds, showing that it is not due to an insolubilisation of them. In sialic acid the highest bioaccessibility is obtained for human milk, followed by starter formulas and follow-on ones. On the other hand, in the case of gangliosides, the order, from the higher to the lower bioaccessibility, corresponds to the follow-on formulas, human milk and finally, starter formulas. With the aim of starting studies of bioavailability, the content and profile of sialic acid and gangliosides is characterized in the Caco-2 cellular line, differentiated cells and non differentiated ones. An evaluation of the cytotoxicity of the main gangliosides (GM3 and GD3) to the concentrations found in the soluble fractions of the samples analyzed is performed, by means of cellular viability (trypan blue) and mitochondrial integrity (MTT) tests, with non toxic effect observed.