Estudio de los mecanismos de acción de compuestos que modifican la fermentación ruminal en pequeños rumiantes

Resumen

1. Introducción y motivación de la tesis La producción animal en Europa ha de orientarse, como respuesta a la demanda social, hacia sistemas productivos que sean lo más eficientes posible para, por un lado, optimizar su productividad y competitividad, y por otro, minimizar su impacto ambiental. En el caso de los rumiantes, es la actividad fermentativa que ocurre en el rumen la que determina la eficiencia de utilización de los nutrientes de la dieta. La fermentación anaerobia ruminal implica que tanto el uso de la energía como el de proteína sean ineficientes para el animal. La fermentación ruminal produce metano, que representa una pérdida (entre el 2 y el 12 %) de la energía ingerida por el animal (Johnson and Johnson, 1995); también produce un exceso de amonio y de urea que se excreta en la orina (Eckard et al., 2008) y que representan una pérdida de nitrógeno (alrededor del 60 % del ingerido). Esta doble ineficiencia tiene implicaciones medioambientales a escala global y local, respectivamente. La nutrición correcta del rumiante implica, entre otras cosas, minimizar estas ineficiencias mediante una formulación adecuada de la dieta. Además, el empleo de sustancias modificadoras de la fermentación ruminal, por su capacidad específica de inhibir o potenciar el crecimiento de ciertos grupos microbianos, es una estrategia alimentaria con un gran potencial y que ha experimentado un gran desarrollo (Hart et al., 2008; McAllister, T. y C. J. Newbold, 2008). Dada la importancia de la microbiota que existe en el rumen uno de los métodos más efectivos y sencillos para modificar la fermentación ruminal se basa en la utilización de compuestos antimicrobianos, fundamentalmente antibióticos ionóforos, considerados como promotores del crecimiento. Sin embargo, desde enero de 2006, está prohibido el empleo de antibióticos en la alimentación animal en los países de la Unión Europea (Casewell et al., 2003). El mero anuncio, hace unos años, de esa prohibición impulsó el interés de la investigación pública y privada hacia la búsqueda de alternativas a los mencionados antibióticos. En rumiantes, se han estudiado como alternativas levaduras, ácidos orgánicos, probióticos, extractos de plantas, aceites esenciales, enzimas, etc. La literatura científica ofrece abundante información sobre los efectos de distintos compuestos sobre la fermentación ruminal (Calsamiglia et al., 2007; Benchaar y Greathead, 2011; Bodas et al., 2012). Esta información es difícil de interpretar, y en ocasiones, los resultados obtenidos en los diferentes experimentos son contradictorios. La importancia económica a nivel mundial, del ganado vacuno ha hecho que la mayoría de los estudios llevados a cabo se centren en esa especie ganadera, siendo escasos los estudios relativos al ganado ovino o caprino. En nuestro país, sin embargo, los pequeños rumiantes tienen una extraordinaria importancia económica y social. El desarrollo y empleo práctico de aditivos, con capacidad para modificar la fermentación ruminal y mejorar la productividad del rumiante, se enfrenta en la actualidad a una serie de limitaciones científico-técnicas, que conviene considerar en su conjunto para tratar de solventarlas (Calsamiglia et al., 2007; Benchaar y Greathead., 2011). Entre esas limitaciones, se pueden destacar: - La variación de su efecto dependiendo del tipo de compuesto activo y su concentración. - La variación de su efecto en función de la naturaleza de la dieta que recibe el animal. - Las diferencias entre los resultados obtenidos in vitro e in vivo y la dificultad para utilizar condiciones de experimentación similares en ambos tipos de ensayos. - La carencia de estudios que confirmen la persistencia en el tiempo de los efectos de los aditivos. Estas limitaciones, sin duda alguna, están ligadas a la falta de conocimiento que aún se tiene del ecosistema microbiano del rumen y de la actividad metabólica de distintos grupos microbianos. Ello limita, a su vez, el conocimiento de los mecanismos de acción mediante los que los compuestos estudiados modifican la fermentación ruminal. El objetivo general del presente trabajo es contribuir a superar las limitaciones mencionadas, en relación a la metanogénesis, mediante el estudio de los mecanismos de acción de diversos compuestos que pueden modificar la fermentación ruminal: i) compuestos organosulfurados derivados del ajo, ii) aceites esenciales y, iii) compuestos de síntesis. Los objetivos específicos que se plantean en este trabajo de Tesis Doctoral son los siguientes: ¿ Estudiar, mediante incubaciones de corta duración en cultivos no renovados de microorganismos ruminales, el efecto de una serie de aditivos y dosis de los mismos sobre la fermentación ruminal para establecer su potencial antimetanogénico. ¿ Establecer el efecto del tipo de concentrado de la dieta sobre la efectividad de los aditivos estudiados. ¿ Estudiar, mediante incubaciones en fermentadores de flujo continuo, el efecto de los aditivos y dosis seleccionadas anteriormente sobre la fermentación ruminal a tiempos de administración más prolongados. ¿ Estudiar, en ovino y en caprino, el efecto sobre la fermentación y degradación ruminal, respuesta digestiva y producción de metano de la aplicación de los aditivos y las dosis que mostraron resultados más prometedores en las incubaciones in vitro, tanto a corto como a más largo plazo. ¿ Establecer los mecanismos de acción de aditivos con un mayor potencial antimetanogénico, que no comprometan la fermentación ruminal de la dieta, mediante el estudio de los cambios que dichos aditivos promueven, tanto in vitro como in vivo, en las comunidades microbianas ruminales y, en particular, en las arqueas metanogénicas. 2. Contenido de la investigación Se han llevado a cabo cuatro experimentos in vitro y cuatro in vivo para estudiar el efecto de aditivos, derivados de plantas o sintéticos, sobre la fermentación ruminal, la producción de metano y distintos grupos microbianos del rumen. El estudio in vivo, tras conocer los efectos de los aditivos in vitro, está sujeto a una serie de limitaciones. Igualmente el uso de aditivos en condiciones prácticas tiene una serie de limitaciones. Entre esas limitaciones destacan la variación en el efecto de los aditivos dependiendo del tipo de compuesto activo y su concentración así como de la dieta que recibe el animal; las diferencias entre los resultados obtenidos in vitro e in vivo; la falta de estudios acerca de la persistencia temporal de los efectos de los aditivos y; el desconocimiento de los mecanismos de acción de la mayoría de los compuestos antimetanogénicos estudiados recientemente. En la presente tesis se pretende responder a los interrogantes que existen acerca del uso de aditivos en la alimentación de rumiantes, tratando de conocer los posibles mecanismos de acción de los compuestos que presentan un efecto antimetanogénico más claro, sin comprometer la fermentación ruminal. La Publicación 1 recoge los resultados obtenidos en dos experimentos in vitro en los que se estudiaron los efectos de una serie de aceites esenciales y compuestos organosulfurados sobre la fermentación ruminal, la producción de metano y las poblaciones microbianas. Esta publicación también recoge los resultados de un experimento in vivo, de corta duración (9 días), realizado en caprino, para estudiar el efecto del compuesto que se mostró más prometedor en los experimentos in vitro, en cuanto a su potencial para reducir la producción de metano. El primer experimento in vitro consistió en incubaciones de 24 horas, en cultivos no renovados de microorganismos ruminales con líquido ruminal de caprino como inóculo, de carvacrol (CAR), cinamaldehido (CIN), eugenol (EUG), propyl propano tiosulfinato (PTS), propyl propano tiosulfonato (PTSO), diallyl disulfuro (DDS), una mezcla (40:60) de PTS y PTSO (PTS+PTSO) y bromoclorometano (BCM), un compuesto sintético antimetanogénico, que se utilizó como control positivo. Se ensayaron 4 dosis (40, 80, 160 y 320 ¿l/l) de los diferentes compuestos, todas ellas con 2 tipos de dieta (50:50, heno de alfalfa:concentrado), que diferían en cuanto a la fuente de almidón y proteína del concentrado en cada una de ellas. La producción de gas a las 24 horas descendió linealmente con dosis crecientes de todos los compuestos, excepto del EUG y de la mezcla PTS+PTSO, observándose una interacción de la dosis del compuesto con la dieta con CAR, PTS, PTSO y DDS. La concentración de AGV totales descendió también linealmente con dosis crecientes de PTS, PTSO y CAR, mientras que la relación acético:propiónico descendió al aumentar la dosis de PTS, PTSO y BCM. Estos resultados, obtenidos in vitro con incubaciones de 24 h, permitieron seleccionar dos dosis de los siguientes compuestos: PTS, CAR, CIN y BCM (160 y 320 ¿l/l), PTSO (40 y 160 ¿l/l) y DDS (80 y 320 ¿l/l) para su estudio en incubaciones de 72 horas (experimento 2) utilizando también cultivos no renovados de microorganismos ruminales. La cinética de producción de gas se vio afectada por todos los compuestos, al igual que la producción de metano a las 24 horas, aunque el mayor descenso se observó con el PTS (96%), DDS (62%) y BCM (95%). La digestibilidad de la fibra neutro detergente, tras 72 horas de incubación, solo descendió con el CAR y PTS. Las concentraciones, a las 24 horas, de arqueas y protozoos, descendieron únicamente con DDS y PTS, respectivamente. Por último, cabe destacar la ausencia de interacción entre las dosis y las dietas utilizadas. A partir de los resultados derivados de las incubaciones durante 72 h se seleccionó el PTS para estudiar su efecto sobre la producción de metano, en caprino, durante 9 días de tratamiento. En este experimento también se utilizó el BCM como control positivo. Se utilizaron 32 cabras de raza murciano-granadina alimentadas, a nivel de mantenimiento energético, con una única dieta (55:45 heno de alfalfa:concentrado) en la que el concentrado era una mezcla de los dos utilizados en los experimentos in vitro previamente descritos. Las dosis utilizadas fueron 50, 100 y 200 ¿l/l de contenido ruminal y día para el PTS y 50, 100 y 160 mg/l de contenido ruminal y día para el BCM. Se observó un descenso de la producción de metano, expresada en l/kg de MS ingerida, de alrededor del 33% con el PTS y del 64% con el BCM siendo, en ambos casos, inferior a la reducción observada in vitro con dosis similares (87 y 96%, respectivamente). Estos resultados sugieren que los efectos observados con dosis similares son inferiores en el rumen que en los sistemas in vitro, lo que ha de tenerse en cuenta. La publicación 2 recoge los resultados obtenidos en un experimento in vitro, realizado con 8 fermentadores de flujo continuo, inoculados con liquido ruminal de caprino a los que se adicionó DDS (80 ¿l/l), PTS (200 ¿l/l) y BCM (160 mg/l), este último como control positivo, durante dos periodos de 12 días de incubación. Los compuestos y la dieta (heno de alfalfa y concentrado en proporción 50:50) utilizada se seleccionaron a partir de los resultados obtenidos en los ensayos in vitro, incluidos en la publicación 1. No se observaron efectos ni del DDS ni del PTS sobre los parámetros fermentativos, mientras que con el BCM se observó un descenso de la concentración de AGV totales. En cada periodo, el último día de incubación, se obtuvo contenido de cada fermentador, que se utilizó como inóculo de cultivos de microorganismos ruminales en los que se incubó durante 24 h la misma dieta que recibía el fermentador del que procedía el inóculo, para estudiar el efecto de los distintos tratamientos sobre la producción de metano. Se observó un descenso de la producción de metano con el PTS (48%) y BCM (94%), comparados con el control y una ausencia de efecto con el DDS, con las mismas dosis utilizadas en los fermentadores. Respecto a las poblaciones microbianas se observó una disminución de la concentración de arqueas metanogénicas a partir del día 4 de tratamiento con el BCM mientras que con el PTS el efecto sobre este grupo microbiano desapareció a los 12 días de incubación aunque la disminución de metano continuaba. El análisis, mediante pirosecuenciación, del ADN de las muestras del contenido de los fermentadores, recogidas a los 12 días de incubación, reveló que el tratamiento con PTS promovía una reducción de la abundancia relativa de las arqueas del orden Methanomicrobiales y del género Methanomicrobium y un aumento de la abundancia relativa de arqueas de los géneros Methanobrevibacter y Methanosphera. El BCM también produjo un efecto similar al observado con el PTS sobre las arqueas metanogénicas, aunque más marcado que el del PTS, lo que podría estar asociado a un efecto más pronunciado del BCM sobre la producción de metano. Respecto a las bacterias totales tampoco se modificó su concentración aunque el análisis mediante pirosecuenciación, reveló únicamente en el caso del BCM, un cambio en la estructura de la población de bacterias, aumentando la abundancia relativa de las bacterias del género Prevotella y disminuyendo las del género Ruminococcus. Dichos resultados sugieren una adaptación o degradación de los microorganismos al compuesto DDS, al desaparecer el efecto sobre la producción de metano tras 12 de incubación, así como cambios en la estructura de la población de arqueas metanogénicas en los fermentadores en ese periodo, asociados a un descenso de la producción de metano, sin afectar, en el caso del PTS, a la concentración de arqueas metanogénicas. La Publicación 3 recoge los resultados obtenidos en un experimento in vivo, de larga duración (36 días), realizado para estudiar el efecto del PTS fijado en ¿-cyclodextrina (CD- PTS) (200 mg/l de volumen ruminal). Se utilizaron 12 cabras adultas, de raza murciano- granadina, canuladas en rumen, alimentadas a nivel mantenimiento energético con una dieta constituida por heno de alfalfa y concentrado en relación 50:50. Seis cabras se trataron con CD-PTS y las otras 6 no recibían aditivo. No se observó efecto del CD-PTS sobre la producción de metano, concentración de AGV, abundancia de distintos grupos microbianos y la digestibilidad de los nutrientes, si bien la estructura de la población de arqueas metanogénicas de los animales tratados con CD-PTS durante 28 días, se agrupó en un clado diferenciado, que podría asociarse con un descenso numérico, no significativo, de la producción de metano en los animales tratados de alrededor de un 10% considerando el mismo tiempo de tratamiento. Además, se estudió el efecto del PTS (200 ppm) sobre las siguientes especies de arqueas metanogénicas: Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter millerae, realizándose incubaciones de cultivos puros durante 12 días. El PTS redujo la cantidad de metano producido por todas las especies de arqueas estudiadas. Este resultado apoya la hipótesis de que dicho compuesto afecta a estos microorganismos a corto plazo, observándose efecto antimetanogénico tanto en fermentadores (12 días) como en el experimento in vivo de corta duración (9 días). La falta de efecto del aditivo sobre la producción de metano en el experimento in vivo de larga duración pudiera deberse a una adaptación de las arqueas a la acción del compuesto o a una degradación del mismo por parte de otros microorganismos. Al igual que ocurre con otros compuestos derivados del ajo el PTS afecta a la distribución de las especies de arqueas en el ecosistema ruminal, sin afectar a su biomasa total, manifestándose dichos cambios tras un tiempo relativamente prolongado de tratamiento (28 días). Por tanto, se requieren nuevos estudios para corroborar si dosis superiores a las utilizadas en este trabajo o vías más eficientes de administración del compuesto, tendrían un efecto diferente sobre las emisiones de metano y la fermentación ruminal in vivo. La publicación 4 recoge los resultados de un experimento in vitro y dos in vivo, realizados para estudiar el efecto de dos compuestos sintéticos, ethyl-3-nitrooxy propionate (E3NP) y 3-nitrooxypropanol (3NP), con potencial antimetanogénico, sobre la producción de metano, parámetros fermentativos y los principales grupos microbianos del rumen. Mediante incubaciones de 24 h en cultivos no renovados de microorganismos ruminales se ensayaron dos dosis (40 and 80 ¿l/l) de E3NP y ENP observándose un reducción considerable (hasta de un 95%) de la producción de metano con ambos compuestos, sin afectar a la concentración de AGV totales en el rumen. Los experimentos in vivo se llevaron a cabo durante 15 (experimento 2) y 30 días (experimento 3). En el experimento 2, con un diseño de intercambio, se utilizaron 6 ovejas canuladas en rumen, alimentadas a nivel de mantenimiento energético, con una dieta de heno de alfalfa y cebada (60:40) y dos dosis de E3NP (50 and 500 mg/animal y día). A los 15 días de tratamiento con la dosis más alta se redujo (29 %) la producción de metano observándose también un descenso en la relación acético:propiónico. En el experimento 3, también con un diseño de intercambio, se utilizaron 9 ovejas canuladas en rumen, alimentadas de la manera ya descrita para el experimento 2, y tratadas con una sola dosis (100 mg/animal día) de los compuestos E3NP y ENP durante 30 días. Se observó una reducción de la producción de metano a los 14 (14 y 25 % para E3NP y 3NP, respectivamente) y 30 días (21 % para ambos compuestos) y una reducción de la relación acético:propionico en ambos casos. Por último, la concentración de bacterias totales, arqueas y protozoos en el rumen de ovejas no se vio afectada por ninguna de las dosis ni de los compuestos ensayados. Los resultados obtenidos muestran que ambos compuestos tienen un potencial antimentanogénico in vivo, tanto a corto como a largo plazo, sin afectar a la fermentación ruminal negativamente. Sin embargo, la reducción de metano observada in vivo es menor que la observada in vitro, con dosis similares de los mismos compuestos. Debido a las discrepancias observadas entre los resultados in vitro e in vivo, con compuestos y dosis similares, cobra especial importancia ratificar in vivo lo observado in vitro, en cuanto al efecto de aditivos de carácter antimetanogénico. Diversos factores pueden explicar las discrepancias in vitro vs in vivo: la baja solubilidad en agua de algunos compuestos que haría que la homogeneidad de su distribución en todos los compartimentos del rumen no se lograse plenamente; una posible adaptación temporal de los microorganismos a los aditivos; la vía de administración de los compuestos podría limitar su permanencia en el rumen; la degradación de los compuestos podría ser distinta in vitro que in vivo; el procesado del contenido ruminal, previo a su inoculación en los sistemas in vitro, también podría influir en los efectos observados puesto que dicho procesado modifica la microbiota ruminal. Por último, es importante señalar que los resultados obtenidos refuerzan la hipótesis de que la abundancia relativa de distintas especies de arqueas en el rumen juega un papel más importante en la producción de metano que el número absoluto de microorganismos metanogénicos. Serían necesarios nuevos experimentos para confirmar dichos efectos en animales en producción. 3. Conclusiones Teniendo en cuenta los objetivos abordados y los resultados obtenidos se pueden establecer las siguientes conclusiones: 1. Las incubaciones de corta duración, realizadas in vitro, mostraron que entre los aditivos estudiados los de mayor potencial para reducir la producción de metano fueron los compuestos organosulfurados, propil propano tiosulfinato y diallyl disulfuro, y los compuestos sintéticos ethyl-3-nitrooxy propionato y 3-nitrooxypropanol. El tipo de concentrado moduló el efecto del aditivo a las 24 horas y no a las 72, lo que parece relacionarse con su degradación en el rumen, generalmente rápida e inferior a 24 horas. 2. El efecto antimetanogénico del propil propano tiosulfinato se mantuvo tras 12 días de incubación en fermentadores de flujo continuo. Sin embargo, el del diallyl disulfuro desapareció, posiblemente debido a una adaptación de la microbiota ruminal a la presencia de éste compuesto. 3. El suministro de propil propano tiosulfinato a caprino, durante 9 días, y de ethyl-3- nitrooxy propionato y 3-nitrooxypropanol a ovino, durante 15 días, disminuyó la producción de metano un 33% y 27%, respectivamente. Tras un tiempo más prolongado de tratamiento (28 y 30 días, respectivamente) el efecto antimetanogénico desapareció en el caprino tratado con propil propano tiosulfinato y se mantuvo (21%) en ovino tratado con ethyl-3-nitrooxy propionato y 3-nitrooxypropanol. La naturaleza del compuesto estudiado y su dosis, la forma de administración al animal, el tiempo de tratamiento y la especie animal pueden condicionar el efecto antimetanogénico de los aditivos. 4. En fermentadores de flujo continuo la reducción de la producción de metano producida por el propil propano tiosulfinato está asociada a un cambio en la estructura de la población de arqueas, aumentando la abundancia relativa de especies de los géneros Methanobrevibacter y Methanosphaera y disminuyendo las del género Methanomicrobium, sin afectar a la biomasa total de la población de arqueas. En incubaciones cortas in vitro y en el rumen de caprino y ovino tampoco se observaron cambios de la biomasa total de arqueas con aditivos antimetanogénicos. Los cambios en la estructura de las arqueas en el rumen de caprino se ponen de manifiesto tras la administración del propil propano tiosulfinato durante al menos 4 semanas. 5. La efectividad de la reducción en la metanogénesis de una determinada dosis de un aditivo es 35-80% menor in vivo que in vitro, lo que podría deberse a factores tales como la homogeneidad de la distribución del aditivo en el rumen, la adaptación temporal de los microorganismos al mismo, la forma en que se administra al animal, su degradación diferencial en el rumen y en condiciones in vitro o el procesado del contenido ruminal, previo a su inoculación en los sistemas in vitro. 4. Bibliografía Benchaar, C. y H. Greathead. 2011. Essential oils and opportunities to mitigate enteric methane emissions from ruminants. Animal Feed Science and Technology 166- 167:338-355. Bodas, R., N. Prieto, R. García-González, S. Andrés, F. Giráldez, y S. López. 2012. Manipulation of rumen fermentation and methane production with plant secondary metabolites. Animal Feed Science and Technology 176(1-4):78-93. Calsamiglia, S., M. Busquet, P. W. Cardozo, L. Castillejos, y A. Ferret. 2007. 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