Implicación de la fosfatasa alcalina en la inflamación intestinal

Resumen

La fosfatasa alcalina es una enzima ¿clásica¿, conocida desde antiguo a nivel puramente bioquímico, pero también clínico. Por ejemplo, la determinación de los niveles plasmáticos para la detección de colestasis es harto conocida, así como su presencia en múltiples tejidos y tipos celulares, que de hecho le confieren un carácter prácticamente ubicuo. Además, la AP es una enzima muy antigua desde el punto de vista filogenético, puesto que está presente no sólo en el hombre, sino en mamíferos, vertebrados e incluso bacterias. Resulta sorprendente, por tanto, que hasta hace pocos años no se supiera prácticamente nada sobre la función desempeñada por esta enzima [1]. La fosfatasa alcalina (AP) de mamíferos (ortophosphoric monoester phosphohydrolase-alkaline optimun, EC 3.1.3.1) es una familia de enzimas (glucoproteínas) que hidrolizan moléculas de fosfato a pH alcalino. Al menos 4 isoformas de AP se han descrito en humanos, la no específica de tejido (TNAP) o isoforma de hueso/hígado/riñón (BAP/LAP/KAP), además de la intestinal (IAP), la de placenta y la de células germinales, que se expresan predominantemente en estos tejidos. La isoforma IAP se expresa en intestino delgado mientras que la TNAP se expresa en intestino grueso [2]. La isoforma TNAP está codificada por un solo gen que da lugar a las isoformas de hígado, hueso y riñón, que difieren a nivel de ARN mensajero (ARNm), ya que el primer exón es distinto en la isoforma ósea (exón 1A) y en las de hígado y riñón (exón 1B) [3, 4]. No obstante, la composición en aminoácidos de las 3 isoformas es idéntica, ya que el primer exón no se traduce. Además, hay diferencias entre estas isoformas en cuanto a sus sensibilidad a inhibidores químicas y al calor, que se atribuyen a diferencias en sus patrones de glucosilación [5]. De hecho, la forma hepática es más resistente a la inhibición por levamisol u homoarginina que las formas riñón y ósea. Las isoformas de placenta e intestinal tienen una similitud del 87-90% a nivel genómico y muestran en general analogías en cuanto a sus sensibilidad a inhibidores químicos [6-8]. Al igual que estas, la forma hepática es resistente al levamisol. La AP se localiza en la membrana del borde del cepillo del intestino y no ha tenido ninguna función conocida en el intestino hasta hace poco, a pesar de que tradicionalmente se le ha asignado un papel difuso en el transporte intestinal de lípidos y nucleótidos [9, 10]. De hecho, los ratones knock-out de IAP presentan una mayor absorción de grasa, pero ninguna alteración de importancia [11]. La IAP se localiza en partículas lipídicas en el intestino [12]. Por el contrario, la supresión de la TNAP en ratones conduce a la muerte postnatal temprana, por razones no relacionadas con el intestino, aunque estos animales sí presentan alteraciones en la fisiología intestinal [13]. Posteriormente el LPS ha sido identificado como sustrato de la AP [14] y se ha descrito que en ratones knock-out de IAP se produce una mayor translocación bacteriana después de episodios de isquemia-reperfusión [15]. Se ha sugerido también que la AP podría tener una función protectora, sustentada por el efecto nocivo del levamisol, un inhibidor de la AP administrado a ratas infectadas con E. coli por vía intraperitoneal. La denominada enfermedad inflamatoria intestinal (EII) hace referencia a dos enfermedades distintas aunque ampliamente relacionadas entre sí, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa [16]. Ambas tienen en común el ser enfermedades inflamatorias del intestino de carácter crónico y recurrente, de tratamiento difícil y cuya etiología es esencialmente desconocida [17]. La incidencia de la EII está en aumento, en especial en España [18, 19] y en general en los países desarrollados. Aunque, como se ha mencionado, se desconoce la etiología de la EII, parece claro que la flora intestinal es determinante en el desarrollo de los acontecimientos que dan lugar a las recaídas. De hecho, se cree que la EII es consecuencia de una respuesta exacerbada e incontrolada a antígenos luminales que son inocuos para la población normal. Estudios previos de nuestro grupo de investigación demostraron la inducción de la actividad AP en diferentes modelos de colitis experimental en rata y ratón [20]. Todos los modelos de inflamación colónica e ileal que se examinaron, caracterizados por un significativo estrés oxidativo e infiltración leucocitaria, dieron lugar a un incremento en la actividad AP en colon (e íleon en el modelo de ileítis). El incremento de la sensibilidad a los inhibidores levamisol y homoarginina, junto con los cambios aparentes en el tamaño molecular y en la sialización de la enzima, apuntaban a un cambio de isoforma, presumiblemente de la forma hepática a la renal. De hecho, se observó un incremento de la expresión de TNAP mediante Western blot. En consecuencia, existe un incremento de expresión de TNAP en el intestino inflamado que está asociado a un cambio de isoforma dentro de este tipo enzimático, concretamente de la forma hepática (resistente a levamisol y homoarginina) a la renal u ósea. Este cambio es achacable en parte a la infiltración de neutrófilos y posiblemente otros leucocitos, que expresan este tipo de AP, pero también a una modulación de la expresión que tiene lugar en el epitelio. Se trata por tanto de un marcador de inflamación intestinal. Además, experimentos in vivo utilizando el modelo de colitis inducida por TNBS en rata pusieron de manifiesto que el tratamiento con levamisol o con el anticuerpo monoclonal B4-78 tenían cierto carácter protector, lo que sugería un posible papel patológico. Basado en estos datos, nuestro primer objetivo fue caracterizar el efecto del estrés oxidativo sobre la AP en el epitelio intestinal. Una vez caracterizado, decidimos estudiar el efecto terapéutico de la administración de IAP en modelos de colitis experimental y finalmente obtuvimos unos ratones heterocitgotos para la expresión de TNAP, que utilizamos para caracterizar la implicación de dicha isoforma no sólo en la EII sino también en la mucositis y en la infección bacteriana intestinal. En una primera aproximación, se estudió el efecto sobre la actividad AP de varios estímulos oxidantes en líneas celulares en cultivo de epitelio intestinal (CACO-2, IEC-18, HT-29 y T-89) in vitro. La adición a estas células de terbutilhidroperóxido, peróxido de hidrógeno y monocloramina, provocó un incremento de la actividad AP, que estuvo asociado a un incremento a la sensibilidad a levamisol, homoarginina y al calor. Así mismo se estudió el estado de la glucosilación utilizando inhibidores como la tunicamicina y se estudió el estado de activación de las vías de señalización de las MAPK, NF-¿B, AMPc y calcio. Teniendo en cuenta todos estos resultados, podemos concluir que la TNAP es inducida en células del epitelio intestinal en condiciones de inflamación/estrés celular, por un mecanismo que implica principalmente cambios en el patrón de glucosilación, con un papel menor, si acaso, de variaciones en la transcripción/traducción. Para llevar a cabo el segundo objetivo indujimos colitis mediante la administración de ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS) en ratas. En este caso, el tratamiento con IAP da lugar a la protección frente a la colitis experimental en ratas, asociada a una menor translocación bacteriana. Paralelamente, se realizaron varios modelos de colitis experimental, tanto inducida por TNBS como por la administración de sulfato de dextrano sódico (DSS) en los que se valoró la actividad AP colónica así como la actividada AP en heces y otros parámetros inflamatorios. Tras estos experimentos podemos concluir que el colon inflamado de distintos modelos animales de colitis expresa mayores niveles de AP, los cuales se deben al incremento de TNAP del tipo renal u oseo, no de IAP y que la colitis experimental en ratas aumenta actividad fosfatasa alcalina luminal, debido a un incremento de TNAP. El empleo de ratones heterocigotos para la expresión de TNAP nos ha permitido estudiar su implicación en la inflamación intestinal. Para ello llevamos a cabo 4 modelos de colitis experimental (TNBS, DSS agudo, DSS crónico y transferencia linfocitaria), 2 modelos de infección bacteriana intestinal (Citrobacter rodentium y Salmonella Typhimurium) y un modelo de mucositis gastrointestinal inducida por la administración de 5-fluorouracilo (5-FU). A diferencia de los ratones IAP-/-, los ratones TNAP+/- son claramente más susceptibles a la inducción de colitis por DSS, tanto en el protocolo agudo como en el crónico, así como por TNBS. Este fenómeno fue muy consistente y claro, por lo que considereamos que los datos son plenamente representativos. En lo que respecta a los dos modelos de infección, los resultados contratan abiertamente con los obtenidos en los modelos de inflamación, puesto que en este caso los ratones TNAP+/- resultan ser más susceptibles, de forma comparable a lo que se ha observado en ratones IAP-/- [15]. En el modelo de mucositis por 5-FU se observaron diferencias interesantes entre los ratones TNAP+/- y sus respectivos controles, ya que la neutrofilia característica de la mucositis no llegó a producirse en los ratones TNAP+/-. Podemos concluir que la deleción genética de un alelo de la TNAP tiene importantes efectos en la respuesta a estímulos colitogénicos e infección de carácter opuesto: disminuye la susceptibilidad a la colitis mientras que aumenta la sensibilidad a la infección por S. Typhimurium y C. rodentium. 1. 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