Caracterización genética de la síntesis de quitina en Fusarium oxyporum f. Sp. Lycpersicirelación con el proceso de patogénesis

Resum

Tres genes sintasa de quitina estructurales, chs1, chs2 y chs3, se identificaron en Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, patógeno causante de la marchitez vascular en plantas de tomate. chs1, chs2 y chs3 determinan sintasas de quinina estructurales (CHSs) de las clases I, II y III, respectivamente. Se identificó un gen (chs7) que codifica una chaperona mediante la comparación de la proteína deducida con Chs7 de Saccharomyces cerevisiae, una proteína requerida para el transporte de la CHS de clase IV. Los mutantes deficientes en los genes chs1, chs2 y chs7 de F. oxysporum se obtuvieron mediante interrupción dirigida y no parecen existir mecanismos compensatorios entre los genes chs estudiados. Mediante microscopia de fluorescencia empleando una tinción simultánea con Calcofluor White y DAPI, la estirpe silvestre y los mutantes ?chs2 y ?chs7 mostraron una septación y distribución nuclear similares, cada compartimento hifal con un único núcleo, mientras que el mutante ?chs1 mostró compartimentos con hasta cuatro núcleos. Los ensayos de patogenicidad en plantas tomate indicaron una reducción de la virulencia de los mutantes nulos ?chs2 y ?chs7. Condiciones de estrés afectan el desarrollo normal en ?chs2 pero no el de los mutantes nulos ?chs1 y ?chs7. Estos tres mutantes mostraron un aumento de la hidrofobicidad nifal comparada con la estirpe silvestre cultivada en medio suplementado con sorbitol. Por otra parte, mediante la fusión de los genes chs2, chs7 y chsV a sgfp se trató de determinar la localización intracelular de estas tres CHSs. Para ello, se empleó microscopia láser confocal y se observó fluorescencia en el ápice de las hifas en cremiento, pero no se visualizó el Spitzenkörper. Sin embargo, Chs7:GFP se observó en los momentos previo y posterior a la liberación de las esporas, por lo que podría estar implicada en la formación de la pared que separa la espora de la nifa o en la regulación de la liberación de la espora. Además se identificó un nuevo gen sintasa de quitina con motor de miosina (chsVb) en Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Los análisis filogenéticos de la secuencia de aminoácidos deduca del dominio CS2 del gen chsVb, revelaron que ChsVb pertence a la clase VII. Los mutantes nulos ?chsVb sencillo y ?chsV?chsVb doble fueron incapaces de infectar y colonizar las plantas de tomate o de crecer de manera invasiva sobre el tejido del fruto de tomate. Estas estirpes resultaron ser hipersensibles a compuestos que interfieren con el ensamblado de la pared celular fúngica, producían conidias aberrantes y estructuras con forma de bola inflada en las regiones subapicales de las hifas, además presentaron paredes engrosadas, septos aberrantes e hifas intrahifales. Nuestros resultados sugieren que el gen chsVb intervene en el crecimiento polarizado y confirman la importancia de la integridad de la pared celular durante el complejo proceso de infección llevado a cabo por este hongo. Finalmente, mediante microscopia electrónica de transmisión (TEM) se analizó la colonización de tejidos radiculares de plantas de tomate inoculadas con los mutantes no patógenos ?chsV, ?chsVb y ?chsV?chsVb. en comparación con la estirpe silvestre. De esta manera, se determinó que los mutantes analizados fueron capaces de adherirse a la superficie radicular y colonizar los diferentes tejidos de la raíz durante las primeras 48 horas de la inoculación, momento en que se empezaron a observar diferencias de colonización con respecto a la estirpe silvestre. Así, las estirpes mutantes no fueron capaces de colonizar el cortex y el xilema de la zona superior de la raíz, mientras que la estirpe silvestre continuó invadiendo todos los tejidos radiculares analizados. Sin embargo, la planta no produjo ninguna reacción de defensa visible cuando los mutantes colonizaron sus tejidos radiculares y tampoco se detectaron cambios ultraestructurales en las células de estos mutantes.