Análisis funcional de mecanismos de selección molecular que operan en la ruta secretora temprana

Resumen

Introducción La organización estructural y funcional de la célula eucariota depende, en gran medida, de la actividad de la ruta secretora. Los procesos selectivos de transporte vesicular que operan a lo largo de la ruta, aseguran la llegada de las distintas proteínas y lípidos a sus destinos funcionales adecuados. De esta forma, se mantiene la compartimentación necesaria para que los diferentes procesos bioquímicos que tienen lugar en cada orgánulo se lleven a cabo eficientemente. Así, alteraciones en el funcionamiento correcto de la maquinaria del transporte vesicular conllevan importantes problemas para la fisiología celular dando lugar a numerosas enfermedades humanas. Por tanto, comprender los mecanismos moleculares que rigen el transporte de vesículas supone un importante reto para la Biología Celular y la Biomedicina. El tráfico vesicular está mediado por una serie de complejos proteicos citosólicos de cubierta, que se encargan de: generar las vesículas de transporte deformando mecánicamente la membrana del orgánulo donador, seleccionar de manera simultánea las moléculas carga que se han de incorporar en las vesículas, y finalmente, dirigir las vesículas hacia su destino intracelular interaccionando con los factores de acoplamiento. Dos tipos de cubierta operan al comienzo de la ruta secretora: COPII media la exportación de proteínas de secreción del retículo endoplásmico (RE), mientras que COPI está implicada en el transporte retrógrado desde el aparato de Golgi al RE y entre las cisternas del Golgi. Aunque en los últimos años se ha progresado bastante en el conocimiento de la arquitectura molecular de los complejos COPII y COPI, todavía no han sido determinados los mecanismos que coordinan espacio-temporalmente la actividad de estas cubiertas y que son, en gran medida, los responsables de mantener la integridad estructural y la homeostasis funcional de los orgánulos secretores. En esta tesis se ha pretendido profundizar a nivel molecular la comprensión del tráfico vesicular en la ruta secretora temprana, analizando el modo de acción de unas proteínas transmembrana conocidas como proteínas p24, las cuales han sido implicadas en el flujo bidireccional de vesículas que conecta al RE con el Golgi. La familia p24 está conservada evolutivamente y son proteínas extremadamente abundantes, constituyendo casi el 30% de las proteínas presentes en el Golgi. Sus miembros disponen de un tallo citosólico que muestra una gran afinidad para interaccionar con las proteínas de cubierta COPII y COPI. Forman un complejo heteromérico que cicla constantemente entre el RE y el Golgi. Utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo, este grupo de investigación ha demostrado previamente que el complejo p24 participa activamente en la formación de vesículas COPI de transporte retrógrado y que es específicamente requerido como receptor de carga para la exportación selectiva del RE conectando proteínas de secreción luminales, como las proteínas ancladas a GPI, con la cubierta citosólica COPII. Además, el análisis de los estudios proteómicos realizados por nuestro grupo y genéticos a gran escala publicados han sugerido que las proteínas p24 también estarían involucradas conjuntamente con otros receptores de carga del RE, en el ensamblaje tanto de los sitios de salida del RE, como en la cara cis del Aparato de Golgi. Objetivos De este modo, el propósito general de esta tesis ha sido es descifrar los mecanismos moleculares por los que el complejo p24 regula el tráfico vesicular que tiene lugar en la ruta secretora temprana, utilizando la levadura S. cerevisiae como organismo modelo. Específicamente se ha pretendido: - Analizar la regulación de la función del complejo p24 como receptor de carga de las proteínas ancladas a GPI. - Caracterizar la función cooperativa del complejo p24 y otros receptores de carga del RE en la ruta secretora temprana. - Describir molecularmente el papel del complejo p24 en la formación de las vesículas COPI. Resultados 1. Papel del complejo p24 en la exportación de las proteínas ancladas a GPI. Se estima que un 15% de las proteínas de secreción pueden ser ancladas al glicolípico glicosil-fosfatidilinositol (GPI) para ser exportadas desde el RE y alcanzar la superficie celular. Estas proteínas son completamente luminales y requieren del complejo p24 como receptor de carga o adaptador de cubierta, para ser conectadas con las proteínas COPII y así ser eficientemente transportadas hasta el Golgi. No obstante, la salida de las proteínas ancladas a GPI depende también de un proceso de maduración, conocido como remodelación del GPI. La remodelación del GPI a su vez comprende tres etapas diferentes. Inicialmente se describieron las etapas de deacilación del inositol del fosfatidilinositol, y la de sustitución de los ácidos grasos saturados y baja longitud de carbonos (C:18), por otros insaturados y de mayor longitud de tipo diacilglicerol o ceramida (C:26). Estas dos etapas de remodelación son las responsables de la concentración en los sitios de salida del RE de las proteínas ancladas a GPI. Más recientemente se ha descrito una tercera etapa de remodelación en células de mamífero, ésta consiste en la eliminación de la etanolamina-fosfato presente en la segunda manosa del esqueleto de glicano del GPI (EtNP-2), y es desarrollada por al fosfoesterasa PGAP5. A pesar de que esta tercera etapa es necesaria para la exportación de las proteínas ancladas a GPI y para el reconocimiento de las proteínas ancladas a GPI por el complejo p24, actualmente no se conoce cómo la remodelación del glicano se integra dentro del proceso de maduración y exportación de estas proteínas. Tras la remodelación del GPI, las proteínas ancladas a GPI pueden concentrarse en los sitios de salida del RE, pero presentan un requerimiento adicional más, ya que se necesita la participación de una isoforma específica de la subunidad de unión a la carga de la cubierta COPII. Curiosamente, esta isoforma conocida como Lst1p en levaduras y SEC24C/D en mamíferos, presenta la capacidad de unir al complejo p24, al menos en levaduras. En esta tesis se ha demostrado que la etapa de remodelación del GPI desarrollada por PGAP5 en mamíferos también se produce en levaduras, concretamente, gracias a la proteína Ted1p. Además, se ha puesto de manifiesto que la actividad de Ted1p está regulada por la deacilación del GPI desarrollada por la enzima Bst1p/PGAP1, pero es independiente de la etapa de remodelación de los ácidos grasos. Al igual que ocurre en mamíferos, en levaduras la remodelación del glicano del GPI es necesaria para el reconocimiento y unión de las proteínas ancladas a GPI por el complejo p24. En este trabajo se demuestra que es la simple presencia de la EtNP-2 en la estructura del GPI, la responsable de bloquear dicha unión. Empleando GPIs sintéticos carentes de EtNP-2 se ha mostrado, por primera vez, que el complejo p24 ejerce su función de receptor de carga comportándose como una lectina que reconoce al GPI maduro. Del mismo modo, se aportan las primeras evidencias directas de la conexión entre las proteínas ancladas a GPI con las cubiertas COPII específicas que contienen Lst1p. En ensayos de crosslinking se muestra cómo las proteínas ancladas a GPI pueden ser unidas a Lst1p y no a la isoforma general Sec24p, estando esta interacción mediada por el complejo p24. Además, se demuestra que la remodelación del glicano ejercida por Ted1p regula la conexión entre las proteínas ancladas a GPI y la cubierta COPII. Es más, la capacidad de unir a la isoforma Lst1p del complejo p24 también es regulada por este proceso de maduración de sus proteínas carga. Estos datos en conjunto permiten proponer un modelo donde la remodelación del GPI la capacidad del complejo p24 para exportar a las proteínas ancladas a GPI. En primer lugar, la deacilasa Bst1p retiene a los GPI hasta que las proteínas se anclan a ellos. Tras el anclaje, el GPI es deacilado y se inician en paralelo los procesos de remodelación de los ácidos grasos que promueven la concentración de las proteínas en los sitios de salida del RE; y la eliminación de la EtNP-2 que permite el reclutamiento del complejo p24 a los sitios de salida del RE donde se han concentrado las proteínas ancladas a GPI. Una vez unidos a las proteínas ancladas a GPI, y no antes, el complejo p24 recluta a la cubierta COPII específica que contiene las subunidades Lst1p, promoviendo así la exportación eficiente de las proteínas ancladas a GPI. 2. Cooperación entre los receptores de carga en el ensamblaje del cis-Golgi. Los receptores de carga del RE son componentes muy abundantes de la ruta secretora temprana que ciclan continuamente entre el RE y el Golgi en vesículas anterógradas COPII y retrógradas COPI. La función individual de estos receptores es conectar a sus respectivas proteínas de secreción específicas con la cubierta COPII para promover su incorporación eficiente en las vesículas que las llevarán desde el RE hasta el Golgi. Los datos proteómicos y genéticos sugieren que además de esta función individual los receptores desarrollarían una función colectiva necesaria para el ensamblaje del cis-Golgi. En esta tesis se ha estudiado dicha función colectiva. En primer lugar, se aportan evidencias de que el complejo p24 se asocia físicamente con otros receptores de carga del RE constituyendo una plataforma que promueve el transporte eficiente de todos los receptores en su conjunto y consecuentemente de sus cargas. A continuación se muestra como los receptores en su conjunto son necesarios para la homeostasis de los orgánulos tempranos de la ruta secretora, ya que su ausencia combinada promueve la desorganización del cis-Golgi y la hipertrofia del RE. Este fenotipo es característico de los mutantes en los factores de anclaje de las vesículas COPII en el cis-Golgi. Es más, estos factores de anclaje pierden su localización en ausencia de dos o más receptores de carga, mientras que los factores de anclaje de vesículas COPI no ven afectada su localización. Esta deslocalización podría deberse a fallos en el reclutamiento de los factores de anclaje a las vesículas COPII nacientes, ya que se observa una mayor presencia de estos en el citosol tanto por microscopía como por subfraccionamiento. Como estos factores de anclaje necesitan a la cubierta COPII para asociarse a las membranas, el origen de su menor reclutamiento sería la menor estabilización de la propia cubierta a estas membranas, originada por el déficit de señales de unión propiciado por la ausencia de la plataforma de receptores. Por tanto, los datos presentados sugieren que además de ejercer su función individual exportando del RE sus cargas específicas, los receptores de carga podrían cooperar activamente en el mantenimiento de la estructura funcional de la ruta secretora temprana mediante la creación de una supraestructura que estabilice la cubierta COPII en la membrana de las vesículas promoviendo la incorporación de los factores de anclaje. 3. Regulación por el complejo p24 de la activación de la GTPasa Arf1p en el Golgi. El transporte vesicular retrógrado que tiene lugar al comienzo de la ruta secretora, desde las cisternas tardías del aparato de Golgi hasta el RE pasando por las cisternas tempranas, depende de las proteínas de cubierta COPI. La formación de las vesículas comienza gracias a la actividad de la GTPasa Arf1p, que tras intercambiar GDP por GTP, gracias a las GEFs Gea1/2p; recluta a las proteínas de cubierta promoviendo su polimerización. No obstante, es necesaria la presencia de proteínas transmembrana que estabilicen a las cubiertas permitiendo su polimerización. En este sentido, el complejo p24 tiene un papel clave, siendo necesario para la formación de las vesículas. La regulación precisa del proceso de formación de las vesículas COPI no está bien descrita. Los estudios más recientes ponen de manifiesto que las Arf GEFs interaccionan con la cubierta antes de promover la activación de Arf1. Cómo se produce la interacción entre las GEFs y las cubiertas, está aun sin describir. En este estudio se muestra como el complejo p24 es capaz de estabilizar la cubierta COPI en la membrana del Golgi, de interaccionar físicamente con Gea1p a través de dicha cubierta y de favorecer el reconocimiento de Arf1p por parte de Gea1/2p. Estas evidencias indican que el complejo p24 promueve la activación de Arf1p por Gea1/2p estabilizando la cubierta COPI en la membrana del Golgi. Además, se ha propuesto que las Arf GEFs son también necesarias para el reclutamiento a las membranas de los factores de anclaje de las vesículas COPI. En esta tesis también se muestran evidencias de que el complejo p24, no sólo favorece el reclutamiento de Gea1p para su interacción con las cubiertas COPI y promueve la activación de Arf1p, sino que también facilita la interacción entre esta GEF y los complejo de anclaje COG. Por tanto, los datos obtenidos sugieren que las proteínas carga transmembrana, especialmente el complejo p24, son elementos reguladores y localizadores de los eventos de transporte mediado por la cubierta COPI en el transporte retrógrado entre las cisternas del Golgi y entre éste el RE. Conclusiones El complejo p24 participa activamente en los procesos de transporte mediados por las cubiertas COPII y COPI, gracias a su capacidad de unir a ambos tipos de cubierta y de asociarse con otros receptores de carga. Así: - El complejo p24 se comporta como una lectina al reconocer a las proteínas ancladas a GPI tras su remodelación. Posteriormente promueve la exportación de éstas gracias al reclutamiento de la subunidad específica de la cubierta COPII, Lst1p. La unión con las cubiertas se produce mayoritariamente sólo tras la interacción con las propias moléculas carga. - En el transporte RE-Golgi, los receptores de carga cooperan entre ellos para promover el transporte eficiente de sus cargas y más importante aún, para estabilizar a la cubierta COPII a las membranas favoreciendo así el anclaje de las vesículas procedentes del RE al Golgi. - Finalmente, el complejo p24 en el Golgi recluta a las membranas de este orgánulo a las cubiertas COPI, lo que promueve y localiza los eventos de formación de las vesículas de transporte retrógrado. La estabilización de las cubiertas permite el reclutamiento de las Arf GEFs, que una vez en las membranas promueven la activación de Arf1p, desencadenando la formación de las vesículas.