Regulación del mantenimiento de la tetraploidía en células ganglionares de la retina de pollo

Resumen

Resumen: Según la visión clásica de la neurociencia, la reactivación del ciclo celular en neuronas conduce a la muerte celular por apoptosis. Sin embargo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que un elevado número de células ganglionares de la retina de pollo (CGRs) en proceso de migración a la capa de células ganglionares (CCG) prospectiva pueden reactivar el ciclo celular y, en presencia de BDNF, permanecer como neuronas tetraploides. Estas neuronas se caracterizan por expresar el factor de transcripción E2F1 y carecer de su represor, la proteína del retinoblastoma (Rb). En ausencia de BDNF, las CGRs tetraploides sufren la transición G2/M, lo que provoca su muerte por apoptosis poco tiempo después. El mecanismo molecular empleado por BDNF para prevenir la transición G2/M y mantener la tetraploidía en estas neuronas es desconocido. Por lo tanto, uno de los objetivos de esta tesis es dilucidar dicho mecanismo. En primer lugar demostramos que TrkB, el receptor neurotrófico de BDNF, se expresa en una población CGRs que carecen de Rb y expresan p75NTR in vivo. Empleando un sistema que recapitula la diferenciación de las CGRs in vitro, demostramos que el tratamiento con BDNF a concentraciones específicas de TrkB, es capaz de disminuir los niveles de la proteína Cdk1, pero no los de su ARN mensajero (ARNm). También demostramos que BDNF disminuye los niveles de actividad endógena y exógena de Cdk1, promoviendo la fosforilación inhibitoria en su Tyr15. Dicha fosforilación está mediada por TrkB, ya que se puede revertir con el tratamiento con K252a, un inhibidor de tirosín quinasas que se usa tradicionalmente para bloquear la actividad de las neurotrofinas a través de sus receptores de la familia Trk. Sin embargo, demostramos que esta fosforilación es independiente de Wee1, la quinasa responsable de la fosforilación de la Tyr15 en células proliferantes, puesto que este efecto permanece después del uso del inhibidor selectivo de dicha quinasa (MK-1775). También demostramos que el efecto de inhibición de la actividad de Cdk1 está mediado por la fosforilación de su Tyr15, ya que BDNF no puede bloquear la actividad de la forma mutante Cdk1 Phe15 (una forma constitutivamente activa de Cdk1, en la que su Tyr15 se ha sustituido por una Phe) cuando se sobreexpresa en cultivos neurogénicos de retina. Por todo esto, proponemos que la inhibición de la expresión y de la actividad de Cdk1 ocurre a través de un mecanismo dependiente de BDNF, que contribuye al mantenimiento de las neuronas tetraploides en un estado similar a G2. Por otra parte, las neuronas tetraploides sólo llevan a cabo una ronda extra de síntesis de ADN, a diferencia de otras células poliploides del organismo, que pueden llevar a cabo múltiples rondas de síntesis de ADN en ausencia de mitosis. Por lo tanto, nos preguntamos cuáles son los mecanismos responsables de bloquear rondas sucesivas de síntesis de ADN en estas neuronas. Un candidato a la regulación de este proceso es el inhibidor de ciclo celular p27Kip1. Observamos que p27Kip1 se expresa en CGRs susceptibles de convertirse en tetraploides, conocidas por su expresión del marcador de diferenciación p75NTR y por carecer del represor de la transición G1/S, Rb. Llevando a cabo estudios de pérdida de función de p27Kip1 mediante ARN de interferencia (ARNi) en CGRs diferenciadas, observamos un incremento de la incorporación de BrdU con respecto al interferente control. La bajada de los niveles de p27Kip1 se correlaciona con un aumento de la cantidad de ADN en dichas células, pero no se corresponde con un aumento del porcentaje de mitosis, indicando una síntesis lenta de ADN. En conclusión, estos datos sugieren la participación de p27Kip1 en el mantenimiento del estado diploide y tetraploide, impidiendo que se produzcan rondas sucesivas de endorreduplicación.