Generation and characterization of a K-Ras model of Noonan syndrome

Resumen

La mutación K-RasV14I tiene como resultado una activación intermedia de la proteína en comparación con la mutación oncogénica K-RasG12V, permitiendo que sea compatible con el desarrollo embrionario y postnatal. Sin embargo, la expresión de dos copias afecta al desarrollo embrionario resultando en una reducción significativa del número de ratones homozigotos obtenidos de cruces entre ratones heterocigotos, indicativo de que el efecto de esta mutación es dosis génica dependiente. 2. Los ratones que expresan la mutación K-RasV14I desde línea germinal reproducen fielmente muchas de las alteraciones del desarrollo asociadas al Síndrome Noonan (SN), entre las que se encuentran retraso de crecimiento, dismorfia cráneo-facial, alteraciones cardiacas y el desarrollo de un desorden mieloproliferativo. 3. La expresión de la mutación K-RasV14I desde línea germinal induce hiperplasia del corazón asociada con un engrosamiento de la válvula aórtica. Esta hiperplasia se debe a un incremento en el número de cardiomiocitos en división y a un incremento en el número de células madre cardiacas durante el desarrollo embrionario. Ninguna de esta alteraciones aparecen cuando la mutación se expresan en células del miocardio en estadios adultos. Sin embargo, esta alteraciones no se traducen en una disminución de la función cardiaca, como se puede deducir de los estudios de resonancia magnética. 4. La expresión de la mutación K-RasV14I desde línea germinal tiene como resultado el desarrollo de un desorden mieloproliferativo como consecuencia de una expansión de las células LSK, debido a la disminución en su muerte celular programada, así como una expansión en los progenitores mieloides. Este desorden mieloproliferativo se reproduce en estudios de transplantes primarios de médula ósea, lo que corrobora el origen de esta alteración en las células madre. Este desorden hematológico aparece también en ratones que expresan postnatalmente la mutación en células hematopoyéticas. 5. Los ratones K-RasV14I presentan una predisposición tumoral mayor. La supervivencia de los ratones mutantes se encuentra reducida debido al desarrollo de múltiples neoplasias, distintas al desorden mieloproliferativo, entre las que se encuentran linfomas, sarcomas histiocíticos y carcinomas. Además, esta mutación coopera con genes supresores de tumores como Trp53 o p16Ink4a/p19Arf, acelerando la progresión tumoral. 6. Eventos de tipo no genético que causan daño tisular y/o respuesta inflamatoria también cooperan con el desarrollo de lesiones preneoplásicas y de tumores en los ratones que Conclusiones 144 expresan la mutación K-RasV14I desde línea germinal. Así, la pancreatitis crónica inducida por tratamiento con ceruleina indujo la aparición de lesiones pancreáticas preneoplásicas y la administración de nicotina propició el desarrollo de adenocarcinomas en pulmón y en páncreas. 7. La expresión postnatal de la mutación K-RasV14I en todos los tipos celulares únicamente induce el desarrollo de desórdenes hematológicos, pero no de lesiones típicas inducidas por la expresión de las mutaciones oncogénicas K-RasG12V y K-RasG12D, tales como lesiones pancreáticas o pulmonares. Las lesiones pulmonares tampoco se encontraron cuando la mutación se expresa en estadios postnatales en células pulmonares, indicando que las propiedades oncogénicas de la mutación K-RasV14I no son suficientes para inducir el desarrollo de tumores en pulmón. 8. La expresión embrionaria de la mutación K-RasV14I en células acinares en condiciones de pancreatitis crónica, induce el desarrollo de lesiones pancreáticas pre-neoplásicas, como en el caso de las mutaciones oncogénicas. Sin embargo, a diferencia de los ratones K-RasG12V o K-RasG12D, no se encontraron adenocarcinomas, indicando una menor propiedad oncogénica de la mutación K-RasV14I. 9. El tratamiento prenatal con el inhibidor de MEK PD0325901 rescata la letalidad perinatal, así como previene el desarrollo de los defectos en el crecimiento y las alteraciones cráneo-faciales y cardiacas, alteraciones características de los pacientes con SN descritas en el modelo K-RasV14I. Sin embargo, ninguna de estas alteraciones se previenen o mitigan en los ratones tratados al destete. Estos resultados sugieren que los tratamientos solo serán efectivos si se realizan durante el desarrollo embrionario; para lo que se hace indispensable disponer de diagnóstico prenatal en estos pacientes. 10. El tratamiento con el inhibidor de MEK PD0325901 no tiene ningún efecto en la prevención del desarrollo del desorden mieloproliferativo, independientemente del tiempo de inicio del tratamiento. Únicamente se observa un pequeño beneficio en la supervivencia en ratones tratados antes del desarrollo de la enfermedad (estadio prenatal y al destete) debido un retraso en la progresión de la misma. Conclusions 145 1. K-RasV14I mutation induces an intermediate activation state of the protein compared to the K-RasG12V oncogenic substitution, property that allows embryonic and postnatal development. However, the expression of both copies of the mutated allele results in a reduccion of the number of homozygous mice obtained from crosses between heterozygous parentals, indicating that increased dosage of the mutant K-RasV14I protein affects embryonic development. 2. Mice that germline express the K-RasV14I mutation faithfully reproduced multiple NSassociated developmental defects such as growth delay, craniofacial dysmorphia, cardiac defects and development of MPD. 3. Germline K-RasV14I expression induces heart hyperplasia associated with an increased thickening of the aortic valve. This hyperplastic condition is due to an increase in the number of cycling cardiomyocytes and cardiac stem cells during embryonic development, since the expression of the mutation in adult myocardial cells had no consequences. However, theses alterations does not affect the heart function, as illustrated by MRI studies. 4. Germline K-RasV14I expression results in a MPD due to an expansion of the LSK cells by decreasing the programmed cell death, and an expansion of myeloid progenitor. This MPD was reproduced in primary bone marrow transplantation indicating this stem cell origin. Same hematological alteration is also induced by the expression of the K-RasV14I mutation only in hematopoietic cells at postnatal stages. 5. K-RasV14I mice display an increased predisposition to tumor development. Mutant mice present a reduced life span due to the development of multiple malignancies, different to MPD, mostly lymphomas, histiocytic sarcomas and carcinomas. Moreover, K-RasV14I mice efficiently cooperate with tumor suppressors genes such as Trp53 and p16Ink4a/p19Arf accelerating the tumor development. 6. Non-genetic events involving tissue damage and/or an inflammatory response also cooperate with the development of neoplastic lesions and tumors in mice that express germline the K-RasV14I mutations. Thus, chronic pancreatitis, driven by caerulein treatment induces PanIN lesions and nicotine administration promotes the development of pancreatic and lung adenocarcinomas. Conclusions 146 7. Postnatal expression of the K-RasV14I mutation in all type of cells induces the development of a hematological disorder, but not the typical lesions induced by the expression of the oncogenic K-RasG12V and K-RasG12D mutation, such as pancreatic and lung tumors. These lung lesions were not either found when the K-RasV14I mutation is expressed at postnatal stages in lung, indicating that this mutation does not have enough oncogenic properties to elicit lung tumors. 8. The expression of the K-RasV14I mutation in acinar cells at embryonic stages under chronic pancreatitis conditions induces the development of PanIN lesions, similar to the oncogenic mutations. However, in contrast to the K-RasG12V and K-RasG12D mice, no PDAC lesions were found indicating that the oncogenic properties of the K-RasV14I mutation are smaller than the oncogenic ones. 9. Treatment of pregnant mothers with the MEK inhibitor PD0325901 rescues the perinatal lethality and prevents the development of growth defects, craniofacial alterations and cardiac defects, the typical NS-associated features described in the KRasV14I. However, any of these alterations were prevented or ameliorated when the treatment starts at weaning indicating that prenatal testing, that allow the initiation of the treatment at early stages, is needed for the success of this treatment. 10. MEK inhibitor PD0325901 has no effect in preventing MPD development independently of the time of the initiation of the treatment. Only a small benefit in the survival was found in mice treated before the development of the disease or at early stages (prenatal stages or at weaning, respectively) due to a delay in the progression of the disease.