Biogénesis, tráfico y modulación de la función del canal iónico termosensible trpm8

Resumen

El principal candidato molecular responsable de la transducción del frío es el canal TRPM8 (Transient Receptor Potential Melastatin 8). Este canal es activado por frío, por voltaje y por compuestos como el mentol y la icilina, que producen sensaciones refrescantes. Sin embargo, poco se sabe aún acerca de la biogénesis, tráfico y modulación de este canal. El objetivo central de esta tesis es identificar y analizar qué determinantes moleculares del canal termosensible TRPM8 influyen en la modulación de su actividad y tráfico. Esta información es fundamental para conocer sus mecanismos de regulación a corto, medio y largo plazo, ya que cabe destacar que todavía se desconoce en qué medida participan la maduración y la biogénesis del canal en la modulación de su actividad. El trabajo de esta tesis se centra principalmente en el estudio de la N-glicosilación de TRPM8 y de los primeros 80 aminoácidos del extremo N-terminal. TRPM8 es una proteína N-glicosilada en la asparragina 934, tanto en el sistema recombinante como en neuronas de ganglio trigémino, donde el canal se expresa de manera endógena. La contribución de esta modificación post-traduccional tiene dos vertientes. Por una parte la N-glicosilación contribuye en gran medida a la concentración del canal en balsas lipídicas, y por otra influye en las propiedades biofísicas del canal. Durante el estudio del tráfico del canal se observó la localización mayoritaria de TRPM8 en las balsas lipídicas. La N-glicosilación resultó tener un papel importante en la segregación del canal en estos microdominios, puesto que la presencia del mutante no N-glicosilado de TRPM8 (N934Q) en las balsas lipídicas disminuye en un 50%. Por otra parte, el canal TRPM8 no N-glicosilado presenta respuestas reducidas respecto del canal N-glicosilado. Los experimentos de electrofisiología realizados utilizando el mutante N934Q muestran como el mecanismo responsable de esta diferencia está relacionado con el desplazamiento de la curva de dependencia de voltaje de este mutante hacia potenciales más positivos dificultando la respuesta de TRPM8 a sus agonistas clásicos. El estudio de los 80 primeros aminoácidos del extremo N-terminal permitió delimitar dos regiones con diferentes funciones dentro de esta secuencia. La primera es la región comprendida entre los aminoácidos 40 y 80. Estos aminoácidos forman parte de un motivo estructural determinante en el ensamblaje de las subunidades del canal. Cualquier deleción en esta región causa la retención del canal en el retículo endoplasmático, la pérdida de función del canal y la pérdida de FRET entre las subunidades, sugiriendo que estos aminoácidos participan en la correcta oligomerización de la proteína. La segunda región se localiza en los primeros 40 aminoácidos y está implicada en la actividad del canal. Al realizar deleciones dentro de esta región se pudo observar que eliminar una secuencia de unos 10 aminoácidos en esta zona se traduce en un aumento de función. El porqué de este incremento todavía no se puede determinar. O bien esta región interacciona con alguna parte del mismo canal actuando de alguna manera como freno o regulador estructural, o bien forma parte de un sitio de unión con alguna proteína que ejerza esa modulación negativa.