Mecanismos geneticos y moleculares implicados en la plasticidad genomica de fusarium oxysporum

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis F. oxysporum es un patógeno de suelo ubicuo, que está sometido a diversos estreses tanto bióticos como abióticos en continuo cambio en la naturaleza (Agrios, 2014). Actualmente se desconoce la base genética que condiciona su supervivencia o el papel que pudieran jugar, por ejemplo, en las mutaciones espontaneas relacionadas con la adaptación ambiental. A priori parece lógico pensar que algunas de estas mutaciones puedan conferir al patógeno una ventaja selectiva, ya sea desde un punto de vista de la supervivencia o competitividad con otros microorganismos, e incluso en su mismo desarrollo a través de una mejora fenotípica (Barrick, & Lenski, 2013). Sabemos que, a pesar de carecer de ciclo sexual conocido, F. oxysporum tiene gran capacidad de adaptación a diversas condiciones ambientales. Sin embargo, a pesar de estar disponible la secuencia de este microorganismo se desconoce cuáles son los mecanismos asociados a esta variabilidad (Ma& Van Der Does, et al 2010). En este punto surgen preguntas sobre la naturaleza de las mutaciones que pudieran estar relacionadas con la adaptación, además de la dinámica en la frecuencia de las mutaciones a lo largo del tiempo o la repetibilidad de la trayectoria de las mutaciones acumuladas dentro de cada población. Estudios similares con microorganismos y virus han revelado que las tasas de mutación beneficiosas son lo suficientemente grandes como para que las mutaciones múltiples se propaguen simultáneamente, un efecto conocido como "interferencia clonal". Esto significa que el destino de cada mutación depende no solo de su propio efecto sobre el fenotipo, sino también del resto de la variación genética presente en la población. Este es el caso, por ejemplo, de un estudio reciente realizado con S. cerevisiae donde se analizaron poblaciones de levadura con tamaño grande (106) o pequeño (105) durante 1000 generaciones de crecimiento en un medio rico. Los resultados pusieron de manifiesto por primera vez, que las mutaciones rara vez son únicas, sino que más bien se mueven a través de las poblaciones como agrupaciones "compañeras" temporales de mutaciones, aunque no tienen por qué estar relacionadas funcionalmente (Lang et al 2013). Con este objetivo se intentó dar explicación precisamente a la relación entre los cambios genéticos seleccionados en un microrganismo más complejo, como es F. oxysporum, y su relación con la adaptación a una condición ambiental determinada. Para ello se creció la cepa silvestre Fol 4287 en tres condiciones ambientales distintas: infección de plantas de tomate (P), crecimiento en placa sobre medio mínimo (MM) y medio completo (YPGA). Se realizaron cinco líneas independientes con 10 pasajes seriados cada una. Con el objetivo de rastrear e identificar las mutaciones en las poblaciones evolucionadas, se realizó una secuenciación del genoma completo de la última población generada (no. 10), comparando el resultado con la cepa original. Posteriormente se estudió la dinámica evolutiva de algunos eventos a lo largo del todo el experimento De todo el análisis evolutivo anterior, destacaron varios genes que hemos considerado diana por la repetición del evento en una misma condición evolutiva. Este es el caso de FOXG_21009 y FOXG_00016. Uno de ellos FOXG_00016 pertenece a una familia génica cuyo miembro más estudiado es el gen velvet o veA y con la producción de metabolitos secundarios producidos por F. oxysporum (López-Berges, et al 2003). Uno de ellos, el ácido fusárico (FA), se han estudiado en detalle sus dianas celulares y de su función en la patogénesis a través de la eliminación dirigida del gen fub1, que codifica un ortólogo de la policétido sintasa involucrada en la biosíntesis de FA en F. verticillioides y F. fujikuroi. Además, mostramos que la expresión de fub1 está controlada positivamente por el regulador global del metabolismo secundario LaeA, componente del complejo velvet, junto con el regulador de pH alcalino PacC a través de la modulación de la accesibilidad de la cromatina en el locus fub1. 2.contenido de la investigación Se han generado una colección de mutantes de crecimiento espontáneo. Para la selección fenotípica de las mutaciones espontáneas de F. oxysporum, en la cepa silvestre, se ha utilizado diferentes fuentes de nitrógeno Nitrato (NaNO3), Sulfato de Amonio ((NH4)SO4), Metionina (C5H11NO2S), Urea (CO2(NH2)2), Hidroxiurea (CH4N2O2), Glutamina (C5H10N2O3) y Ácido Glutámico (C5H9NO4). Los mutantes se subcultivaron a partir de los sectores aislados, realizando una purificación por cultivo monospórico. Posteriormente se realizó una caracterización de los mutantes espontáneos seleccionados mediante una serie de ensayos fenotípicos, incluyendo el crecimiento y desarrollo, la resistencia al estrés y las funciones de virulencia en comparación con el tipo salvaje. También se han observado grandes reorganizaciones cromosómicas, detectadas mediante la técnica de electroforesis en campo pulsante (CHEF) que permite separar los cromosomas de los diferentes aislados en un gel de agarosa. Se han generado una colección de líneas evolucionadas experimentalmente a partir de la cepa silvestre mediante 10 pasajes seriados a través de plantas de tomate (5 líneas independientes), medio mínimo (5 líneas) y medio completo (5 líneas). Se han caracterizado las líneas obtenidas tras el pasaje 10 mediante ensayos de infección en plantas de tomate (huésped principal) y de Galleria mellonella (modelo animal como huésped secundario). Las poblaciones obtenidas tras el pasaje 10 en las cinco líneas de plantas, medio mínimo y medio completo (15 líneas en total) se han re-secuenciado sus genomas, junto con la cepa silvestre como control, utilizando el método Next-Generation Sequencing (NGS) de segunda generación illumina. La identificación de los cambios en el genoma de las poblaciones, objeto de este estudio, se realizó respecto a la secuencia control prevista en nuestro ensayo en colaboración con el grupo de la Profa. Li-Jun Ma de la Universidad de Massachussetts en Amherst, EEUU. La secuencia de la cepa silvestre fue comparada respecto a la secuencia publicada en la base de datos (NCBI), obteniendo así una secuencia de origen de las poblaciones que incorporara los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) así como las inserciones y deleciones (indels). A partir de aquí se generaron los ficheros de las 15 poblaciones evolucionadas, secuenciadas respecto al control silvestre, donde se anotaron todos los cambios observados. Para la detección y confirmación de los eventos de mayor interés se utilizó una combinación de las técnicas moleculares PCR y RFLP. Por otro lado, se analizó la presencia de variaciones en el número de copias (CNVs) a lo largo de los 15 cromosomas de F. oxysporum. Los resultados mostraron duplicaciones y deleciones de gran tamaño en los cromosomas 1, 2, 3, 6, 10, 13, 14, 15, aunque con diferentes frecuencias. A partir de estos cambios se han diseñado cebadores específicos de las regiones afectadas que han permitido monitorizar dichos cambios de forma rápida y exacta a través de un análisis de PCR cuantitativa a tiempo real. Esto nos ha permitido estudiar la dinámica de las reorganizaciones cromosómicas a lo largo de la evolución, lo que implica poder conocer cuando surgieron y la velocidad con la que se fijaron en la población. se ha realizado un estudio con aislados monospóricos obtenidos a partir del último pasaje de cada una de las líneas y condiciones experimentales. Tras un análisis detallado de los resultados de la caracterización genotípica, se seleccionaron aislados monospóricos y, por lo tanto, individuos genéticamente homogéneos representativos de cada línea evolucionada, con mutaciones diferenciales que permitan estudiar el papel de esas mutaciones en los cambios fenotípicos detectados. Se ha estudiado el papel del Ácido fusárico en la patogénesis fúngica de F. oxysporum. 3.conclusión 1. Este trabajo representa un primer paso para comprender los mecanismos de plasticidad genómica del hongo patógeno multi-hospedador F. oxysporum en distintas condiciones ambientales. 2. Durante el crecimiento de la cepa silvestre Fol 4287 en medio mínimo con distintas fuentes de nitrógeno se originan de manera espontánea variantes de crecimiento con distintos fenotipos. 3. El experimento de evolución experimental con diez pasajes seriados de Fol 4287 por plantas de tomate o placas de medio mínimo o completo, seguido por un análisis de re-secuenciación ha permitido identificar cambios en el genoma en prácticamente todas las poblaciones analizadas. 4. El mayor número de eventos seleccionadas se encontró en la condición experimental más compleja, la planta. 5. La mayoría de las mutaciones seleccionadas durante la evolución experimental afectan a la CDS o la región promotora de los genes. 6. El movimiento de transposones de ADN supuso la principal fuente de variabilidad genética seleccionada en las tres condiciones analizadas. 7. En las tres condiciones de selección se encontraron los mismos CNVs localizados en tres regiones cromosómicas específicas. 8. Se observaron dinámicas con múltiples eventos que se fijaron sucesivamente en la población, ilustrando la importancia tanto del azar como de la selección para determinar los resultados de la evolución. 9. En los pasajes por placas con medio completo (YPGA), eventos en los mismos dos genes se seleccionaron en el mismo orden en múltiples líneas, lo que sugiere que, al menos en esta condición, existe un número limitado de trayectorias de evolución adaptativa. 10. La mayoría de los cambios seleccionadas en las condiciones de placas supusieron una reducción significativa en la capacidad de causar enfermedad en plantas de tomate o el modelo invertebrado Galleria. 11. Algunas de las líneas evolucionadas en plantas de tomate mostraron una reducción significativa en la virulencia sobre Galleria, lo que sugiere que existe una compensación en la virulencia entre los dos tipos de hospedadores. 4. bibliografía Agrios, G.N. Plant Pathology. San Diego, CA, EEUU, Academic Press Inc (2004) Barrick, J.E & Lenski, R.E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14,827–839. (2013) Lang, G, Rice, D.P, Hickman, M.P, Sodergren, E, Weinstock, G.M, Botstein, D, Desai, M.M. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500, 571-574. (2013) Lopez-Berges, M.S, Hera, C, Sulyok, M, Schafer, K, Capilla, J, Guarro, J, Di Pietro, A. The velvet complex governs mycotoxin production and virulence of Fusarium oxysporum on plant and mammalian hosts. Mol. Microbiol. 87, 49–65. (2013) Ma, L.J, Van Der Does, H.C, Borkovich, K.A, Coleman, J.J, Daboussi, M.J, Di Pietro, A, Dufresne, M, Freitag, M, Grabherr, M, Henrissat, B, et al & Rep, M. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464: 367-373. (2010)