Estudio bioquímico, genético y biotecnológico de la ruta catabólica responsable de la transformación de histamina en ácido imidazolacético en "Pseudomonas putida" U

Resum

La histamina es una de las aminas biogénicas más importantes, tanto por su acumulación en los alimentos como por la variedad de efectos nocivos que provoca en el organismo. En esta Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo la caracterización genética y bioquímica de la ruta responsable de la transformación de histamina en ácido imidazolacético en Pseudomonas putida U, identificándose los diferentes genes que codifican las funciones responsables de esta transformación. Estos 11 genes se clasifican en tres clusters catabólicos distintos: - El cluster hin es responsable del transporte de histamina, de su desaminación y de su posterior oxidación. Entre las proteínas codificadas por esta agrupación genética se encuentran: un transportador de histamina (HinA); un transaminasa dependiente de piruvato (HinC); una aldehído deshidrogenasa (HinD) que participa en el proceso de oxidación del aldehído generado tras las desaminación de la histamina, y una proteína reguladora (HinB) que actúa como activador de la expresión de las proteínas mencionadas. Se ha logrado clonar y expresar en un plásmido (pK18::mob), este cluster hin, dotando de este modo a las bacterias transformadas con esta construcción de la capacidad necesaria para convertir la histamina en ácido imidazolacético. - El cluster dad es responsable de dos funciones: por una parte, permite regenerar el piruvato requerido como aceptor del grupo amino en la reacción de transaminación, y, además, participa en un sistema de transferencia de electrones en el que el aceptor final es una citocromo c oxidasa. Además, participa en el catabolismo de cadaverina. Está formado por 3 genes que codifican las siguientes proteínas catabólicas: una alanina racemasa (DadX) que transforma la L-alanina formada por la aminotransferasa (HinC) en D-alanina, y una D-aminoácido deshidrogenasa (DadA) dependiente de FAD (se reduce a FADH2 que se acopla a una cadena de transporte electrónico) responsable de la desaminación de esta D-alanina. - El cluster cox está formado por 4 genes: coxB, coxA, coxC y cox11, que codifican las 3 subunidades y la proteína de unión del complejo citocromo c oxidasa de tipo aa3. Esta proteína es la responsable de la transferencia de electrones al oxígeno, formando parte de la cadena de transporte que genera la energía requerida para la incorporación de histamina. Todos estos resultados permiten diseñar herramientas biotecnológicas que pueden ser aplicadas para la eliminación o reducción de la histamina presente en diferentes fuentes, como algunos de los recombinantes obtenidos en esta Tesis Doctoral. Además, el conocimiento genético y bioquímico de esta ruta permitirá la selección de cepas capaces de degradar la histamina y su utilización como cultivos starters (cultivos iniciadores), así como el diseño de nuevos agentes terapéuticos. Adicionalmente, mediante Ingeniería Metabólica, hemos logrado establecer una nueva ruta útil para la degradación del aminoácido L-histidina mediante la participación del gen que codifica la histidin descarboxilasa (hdc) de Enterobacter aerogenes. Una aplicación interesante sería la confluencia en un mismo microorganismo de los genes del cluster hin1 (hinEABCD), de los genes necesarios para degradar el ácido imidazolacético y el gen hdc, que permitiría catabolizar toda la L-histidina a través del intermediario histamina, y así, elaborar alimentos con bajo contenido en este aminoácido y en sus derivados.