Síntesis de polihidroxialcanoatos en "Pseudomonas putida"estudios bioquímicos, genéticos y ultraestructurales

Resum

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros biodegradables, con propiedades similares a las de los plásticos de origen petroquímico, producidos como acúmulos intracelulares por distintas especies bacterianas. Estos biopolímeros pueden ser utilizados como alternativa a los plásticos convencionales, cuya utilización presenta dos grandes problemas: por un lado proceden de reservas fósiles finitas, por lo que su producción no podrá llevarse a cabo de forma permanente tal y como se hace hoy en día; y por otro, son compuestos no biodegradables cuyos desechos contaminan la biosfera, generando importantes problemas ambientales. La presente tesis doctoral recoge los trabajos realizados sobre la producción de PHAs en distintas cepas de Pseudomonas putida. Se secuenciaron los loci pha (que codifican las proteínas responsables de generar estos acúmulos) de P. putida N y de P. putida DOC21, y se compararon con los de otros pseudomonádidos depositados previamente en las bases de datos. La elevada similitud entre ellos indica que desempeñan las mismas funciones en todas las cepas comparadas. A continuación, se comparó la capacidad para producir este polímero en P. putida N y P. putida U, y se concluyó que P. putida N produce una mayor cantidad de PHAs. Partiendo de esta cepa, se diseñaron distintas estrategias para la obtención de mutantes superproductores de PHAs. Los mutantes P. putida N pMCphaF y P. putida N pK18pha no mejoraron la capacidad biosintética de PHAs con respecto a la cepa silvestre. Sin embargo, el mutante superproductor P. putida N ΔfadBA es capaz de producir más cantidad de PHAs que la cepa silvestre en cualquiera de los medios utilizados, destacando los resultados obtenidos cuando se utilizaron como precursores ácidos fenilalcanoicos. En estos casos la producción de PHAs llegó a ser del 61,26% respecto del peso seco de bacterias. Por otro lado, se obtuvo una cepa de P. putida N capaz de producir R-3-hidroxiácidos, que pueden ser utilizados como sintonas de otras moléculas complejas, tales como vitaminas, antibióticos o antimicrobianos. Para obtener esta cepa se expresó en trans la despolimerasa PhaZ. También se realizaron estudios para determinar la conexión existente entre el sistema de producción de polímeros de reserva, la morfología celular y la resistencia a antibióticos. La cepa P. putida N muestra una morfología filamentosa cuando se cultiva a concentraciones subinhibitorias de ampicilina, como consecuencia de la interacción de ese antibiótico con el proceso de división celular. Sin embargo, cuando se expresa en trans el gen phaF de P. putida U, este mutante presenta una morfología bacilar, probablemente debido a que la resistencia de esta cepa al antibiótico ampicilina se incrementa en dos órdenes de magnitud. Finalmente, se llevó a cabo un análisis de la estabilidad genética de cepas superproductoras de PHAs en P. putida. El cultivo reiterado del mutante superproductor P. putida U ΔfadBA en medios que contienen exclusivamente octanoato como fuente de carbono, conduce a una pérdida de la capacidad para sintetizar PHAs. El análisis genético reveló que en tales condiciones, y probablemente debido al estrés metabólico que supone la acumulación de PHAs, la población bacteriana acumula y selecciona mutaciones que conducen a la pérdida de función de la polimerasa I. Se han identificado un total de 22 errores diferentes en estos mutantes adaptativos que inactivan la polimerasa PhaC1 y que contribuyen a una mayor tasa de crecimiento. Teniendo en cuenta que estas mutaciones inactivan PhaC1, que no se halló ninguna mutación en PhaC2, y que aquellas bacterias que contenían una copia de PhaC1 mutada y otra de PhaC2 nativa no sintetizaban PHAs, se ha propuesto un modelo según el cual la activación de las polimerasas estaría mediada por la formación de dímeros PhaC1-PhaC2. Estos dímeros heteroproteicos prevalecen funcionalmente sobre aquellos otros constituidos por dos copias de la misma proteína (PhaC1-PhaC1 y PhaC2-PhaC2). En definitiva, se ha tratado de integrar estudios genéticos, fisiológicos y morfológicos en unas cepas con gran interés para la producción de bioplástico y cuyo conocimiento es imprescindible para abordar con éxito la producción de estas moléculas a escala industrial.