Análisis de la señalización mediada por la pared celular y el estrés oxidativo en la interacción planta-patógeno

Resumen

Las plantas pueden sufrir diferentes tipos de estreses, uno de ellos es la invasión de patógenos. Cuando tiene lugar la interacción, la planta activa rutas de señalización para generar respuestas de defensa para limitar la expansión del patógeno. Durante la interacción, la pared celular de la planta forma parte de la defensa activa frente a invasores. En los últimos años se ha relacionado a enzimas implicadas en la síntesis, crecimiento y desarrollo de la pared celular de la planta con la susceptibilidad o resistencia frente al patógeno. En estudios previos en nuestro grupo de investigación se identificaron numerosas endo-1,4-β-glucanasas (EGs) de Arabidopsis y de tomate implicadas en las interacciones planta-patógeno. Tras el ataque se produce un estallido oxidativo que resulta perjudicial para patógenos biótrofos, limitando su expansión, mientras que los patógenos necrótrofos lo utilizan en su propio beneficio. Estos patógenos son capaces de producir especies reactivas del oxígeno (ROS), que favorecen el proceso de colonización. En plantas, las ROS actúan como señalizadoras, jugando un papel en la protección de la planta. Al igual que en plantas, algunos patógenos también tienen sistemas para la producción y detoxificación de ROS. La enzima superóxido dismutasa (SOD) cataliza la conversión de superóxido (O2-) a peróxido de hidrógeno (H2O2), que posteriormente se convertirá en agua, que es inocuo, por medio de otros enzimas. La enzima SOD se encuentra en diferentes compartimentos subcelulares de la planta, pero también se encuentra en muchos patógenos. Uno de los complejos enzimáticos productores de ROS es el complejo NADPH (Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) oxidasa (Nox). El NADPH dona electrones al O2, que es reducido a O2- y éste, se dismuta a H2O2 mediante SOD. En hongos, el complejo Nox contiene diferentes subunidades especializadas en la penetración, colonización y expansión del hongo en el tejido del hospedador. Estos aspectos han sido tratados en la presente Tesis doctoral, cuyos objetivos se fundamentan en la caracterización de las respuestas de defensa de las plantas frente a patógenos mediante dos aproximaciones: La primera aproximación consiste en el análisis de la contribución de la pared celular mediante un análisis funcional de plantas de Arabidopsis thaliana deficientes en la enzima hidrolítica de pared Korrigan1 (KOR1) (mutantes de inserción kor1-1) y su cultivar silvestre Wasselewskija (Ws, plantas control), frente a la bacteria hemibiótrofa Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst). Los resultados han revelelado que las plantas kor1-1 son más susceptibles frente a Pst, mostrando diversos símptomas, como deformación foliar y mayor presencia de clorosis, así como mayor crecimiento bacteriano, comparado con las plantas Ws. El análisis hormonal y la expresión de genes mostraron que la ruta del ácido jasmónico (JA) estaba más activo en plantas kor1-1, asociado a un incremento en el gen de biosíntesis de JA, Lox3, y una mayor acumulación de JA. Tras la infección, la acumulación de JA y de JA-Isoleucina (JA-Ile) fue mayor que en las plantas Ws, incrementando Lox3 y el gen de respuesta a jasmónico/etileno (JA/ET) PDF1.2. Adicionalmente, el aumento de ácido salicílico (SA) en plantas control y en plantas kor1-1 refleja la compleja interacción entre JA y SA, que resulta en una gran susceptibilidad mostrada por las plantas mutantes infectadas. La deposición de calosa, un polisacárido que se deposita en la zona de infección tras el ataque por el patógeno, fue mayor en plantas kor1-1 que en plantas Ws. El fenotipo susceptible desplegado por las plantas deficientes en KOR1 es independiente en coronatina, un compuesto mimético en metil-JA que sintetizan algunas cepas de P. Syringae para infectar al hospedador. No se detectaron cambios significativos en el perfil hormonal de las plantas kor1-1 infectadas con la cepa de P. Syringae deficiente en coronatina (CmaA), lo que apoya que la ausencia de la EG KOR1 altera per se, la respuesta de la planta a la infección. Previamente habíamos descrito un aumento de la resistencia frente al hongo necrótrofo Botrytis Cinerea, así pues, la ausencia de esta EG altera las propiedades de la pared celular y las respuestas de la planta en un sentido que beneficia la colonización de P. Syringae pero restringe la invasión de B. Cinerea. En general, los resultados indican que la ausencia de KOR1 produce cambios significativos en algunos de los principales mecanismos de defensa frente a P. Syringae y demuestra que existe una interacción entre la EG KOR1 y las rutas de señalización, como se observó previamente en B. Cinerea (Finiti y col., 2013). Este capítulo de la Tesis muestra que la ausencia de KOR1 interfiere en la resistencia de la planta frente a P. Syringae mediante un efecto de tipo priming, inducido por la ruta de JA y la deposición de calosa y la alteración de la acumulación de ROS. Los datos obtenidos sugieren que la ausencia de KOR1 produce cambios en los mecanismos de respuesta a estrés en la planta que inducen mayor susceptibilidad frente a la bacteria hemibiotrofa. Estos efectos son el resultado de la alteración en la estructura de la pared celular en el mutante debido a la actividad hidrolítica de la EG, estando ausente. Sin embargo, la causa puede ser mediante sensores de la pared celular, que puede percibir la ausencia de productos degradadores de KOR1 y/o estructuras alteradas de la pared celular como señal de alarma. La alteración de la pared celular puede generar un estado de pre-alarma en plantas kor1-1, que induce la ruta de JA y la deposición de calosa, que da lugar a los cambios defensivos observados, que probablemente refleja una alteración de la compleja red de señalización implicada en la defensa de la planta. La otra aproximación se basa en el estudio del papel desempeñado por el estrés oxidativo en las respuestas de defensa en plantas de A. Thaliana N70000 y de tomate (Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig) frente a cepas mutantes del hongo necrótrofo B. cinerea, que son deficientes en actividades enzimáticas implicadas en el metabolismo oxidativo, como la carencia de la enzima superóxido dismutasa Cu-ZnSOD y de las subunidades del complejo Nox. Previamente, se ha demostrado en nuestro grupo de investigación que las plantas de tomate infectadas con B. cinerea acumulan ROS y calosa, junto con la inducción de genes implicados en defensa, señalización y metabolismo oxidativo. En esta parte de la Tesis se estudió el fenotipo de infección de la cepa Δbcsod1 de B. cinerea en plantas de Arabidopsis y tomate. Este mutante carece de bcsod1, que codifica para la enzima Cu-ZnSOD. Δbcsod1 mostró una virulencia reducida en ambos cultivos, comparado con la cepa B05.10 (wildtype, WT). Las plantas infectadas con Δbcsod1 acumularon menos H2O2, pero más O2- que las plantas infectadas con la cepa WT. Esto estaba asociado a una mayor deposición de calosa, apoyando un papel importante de la SOD fúngica en la producción de H2O2 durante la interacción planta-patógeno. La inducción temprana del gen de la calosa sintasa, PMR4, sugiere cambios en ROS y alteración en respuestas de defensa a nivel transcripcional. Los genes y metabolitos implicados en señalización y en respuesta a estrés oxidativo se expresaron diferencialmente en respuesta a la infección con Δbcsod1, apoyando la noción de que las plantas perciben cambios en el balance ROS y activan respuestas de defensa. Un balance O2–/H2O2 parece ser beneficioso para la protección de la planta frente a este necrótrofo. Los resultados destacan, además, la importancia de la deposición de calosa y la acumulación de la oxilipina OPDA (ácido 12-oxo-fitodienoico) en la respuesta a cambios en el medio oxidativo y clarifica los mecanismos que subyacen a las respuestas frente a B. cinerea en plantas de Arabidopsis y de tomate. SOD es importante para la completa virulencia de B. cinerea, dada su habilidad para producir H2O2 y explotar el estallido oxidativo de la planta, como sugirieron previamente Tiedemann (1997) y Rolke y col. (2004). Además, los datos apoyan la idea de que las ROS juegan papeles diferentes en plantas infectadas por B. cinerea, de acuerdo con la dinámica y especificidad de la señalización ROS y la conexión con otras rutas de señalización, como se describió en otros sistemas (Mittler y col., 2011). Por otra parte, se estudió el efecto en las respuestas en plantas de Arabidopsis y de tomate en ausencia de las diferentes subunidades del complejo Nox de B. cinerea (BcNox), una de las mayores fuentes productoras de ROS. Los mutantes ∆bcnoxA, ∆bcnoxAB y ∆bcnoxR mostraron una virulencia reducida en ambos hospedadores. Sin embargo, el mutante ∆bcnoxB presentaba un aumento en la virulencia en plantas de Arabidopsis, pero reducida en plantas de tomate. Esto sugiere que BcNoxB tendría un papel en percepción. Se observó un aumento de la deposición de calosa inducida por el patógeno en ambos cultivos tras la reducida infección con ∆bcnoxA, ∆bcnoxAB y ∆bcnoxR e incluso tras la infección con ∆bcnoxB en plantas de tomate. En cambio, la ausencia de BcNoxB retrasó la acumulación de calosa y no mostró cambios comparado con la cepa WT en plantas de Arabidopsis a tiempo largo. La diferente regulación a nivel transcripcional en el metabolismo de calosa demuestra que su acumulación temprana es determinante para detener la invasión del hongo. El hongo puede manipular las defensas de la planta para facilitar su entrada y expansión mediante factores de virulencia como BcNoxA y BcNoxR, el cual, puede jugar papeles adicionales en el proceso infectivo. El hecho de que BcNoxAB y BcNoxR presenten el mismo fenotipo de infección y deposición de calosa, apoya el papel de BcNoxR como regulador. Tras la infección con los mutantes Δbcnox, se observó una menor acumulación de H2O2 y una mayor acumulación de O2- en ambos cultivos, excepto para ΔbcnoxR en tomate, que mostró una acumulación de ROS similar a la cepa WT a tiempo largo, lo que indica que esta subunidad tiene papeles adicionales. La aplicación de antioxidantes no cambió el fenotipo ROS en ninguno de los mutantes, pero si se observó un cambio en el fenotipo de infección y en la deposición de calosa tras la infección con ΔbcnoxB, mostrando una reducida virulencia y mayor acumulación de calosa en Arabidopsis, mientras que en tomate presentaba mayor virulencia pero con una deposición de calosa similar a la cepa WT. Los resultados sugieren que BcNoxA podría estar implicada en la fase de penetración y BcNoxB podría estar implicado en la producción intracelular de O2- para mantener los niveles basales de ROS necesarios y la señalización redox. Además, se ha podido establecer una correlación entre la deposición de calosa y el fenotipo de infección. La deposición de calosa podría ser un evento temprano e independiente de la alteración en el balance ROS, pudiéndose producir estos dos eventos de forma simultánea. Estas ROS, a su vez, podrían retroalimentar la deposición de calosa y las rutas de señalización. Por lo tanto, en este capítulo de la Tesis se ha demostrado que la ausencia del complejo BcNox produce un impacto en las respuestas de las plantas, que es diferente en Arabidopsis y tomate, mostrando una diferente percepción frente al patógeno y una diferente reprogramación transcripcional en ambos cultivos. La deposición temprana de calosa sería crucial para prevenir la progresión del hongo, estando regulada a nivel transcripcional tras la infección. En futuras investigaciones sería necesario abordar el estudio de la producción de metabolitos, la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo y la señalización y el estudio del posible papel del complejo NADPH oxidasa y del ácido oxálico producido por B. cinerea, con el fin de aportar datos que ayuden a comprender esta compleja interacción planta-patógeno.