Mecanismos moleculares que regulan la migración celular colectiva

Zusammenfassung

La migración celular es un proceso fundamental tanto en el desarrollo embrionario como a lo largo de la vida del organismo. En organismos adultos, tiene gran importancia en los procesos homeostáticos como la respuesta inmune y la reparación de tejidos. La migración celular también puede contribuir a algunos procesos patológicos, incluyendo enfermedades vasculares, enfermedades inflamatorias crónicas y procesos metastáticos (Friedl et al., 2004). Durante el desarrollo, existen dos modos principales de movimiento celular, la migración individual y la migración colectiva. Las células que migran de forma individual son células procedentes de epitelios que mediante una transición epitelio-mesénquima (EMT), en el que tiene lugar cambios en la polaridad y adhesión celular, se delaminan y se convierten en células mesenquimales con capacidad de migrar. La migración colectiva se entiende como el movimiento de varias células, bien formando parte de un grupo, de una fila o de una capa, que mantienen características similares a las células epiteliales. Este tipo de migración no se rige por una EMT como tal ya que no pierde totalmente la identidad epitelial. Existen varios ejemplos de migración colectiva durante el desarrollo como es la gastrulación y de procesos patológicos como la metástasis. En general, la migración celular se considera un proceso cíclico. Este ciclo comienza con la adquisición de una polaridad celular que genera una asimetría espacial entre la parte frontal y la trasera de la célula. Esta polarización se debe a la recepción de señales externas, estímulos quimiotácticos, factores de decrecimiento o proteínas de la matriz extracelular, las cuales determinan la dirección de la migración. Estas señales activan a receptores de membrana situados en el frente celular como son los receptores tirosina kinasas EGFR y PDGF (Forsberg-Nilsson et al., 1998; Simpson and Armstrong, 1999). Estos receptores se activan gracias a la fosforilación de su dominio intracelular por la unión de sus ligandos al dominio extracelular. Otra proteína implicada en el establecimiento de la polaridad celular y en la adhesión y mantenimiento de epitelios es la proteína E-cadherina. Esta proteína ejerce un papel importante en la migración colectiva durante el desarrollo, donde si bien la disminución de los niveles de E-cadherina en el frente de células pertenecientes a un epitelio promueve la migración, el aumento de expresión de esta proteína la inhibe (revisado en Shapiro and Weis, 2009 y en Peinado et al., 2004; Acloque et al., 2009). Esto ocurre en el cierre del tubo neural o durante la gastrulación en el desarrollo embrionario. Esta polarización y la consecuente activación de las rutas de señalización de los receptores EGFR y PDGF, implica la emisión de proyecciones transitorias en el frente celular (Sarmiento et al., 2008). Estas prolongaciones o extensiones, conocidas como filopodios y lamelipodios, son responsables del movimiento celular. Una molécula importante implicada en la formación de estas extensiones es la actina, un componente del citoesqueleto celular. La polimerización y despolimerización de actina para la formación de proyecciones celulares depende de reorganizaciones del citoesqueleto. En este proceso están involucradas las proteínas pertenecientes a las Rho GTPasas, Rac1 y Cdc42 (Sander et al., 1999). Varios estudios han mostrado que la activación de Rac1 o Cdc42 resulta en un incremento de la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente (Ridley et al., 1992; Machesky and Hall, 1997). Una vez formados estos lamelipodios y filopodios, deben anclarse al sustrato, ya sea a la matriz extracelular o a otras células adyacentes. Estos anclajes se denominan adhesiones focales o fibras de estrés. El proceso de unión de las proyecciones al sustrato se lleva a cabo por otro miembro de la familia de las Rho GTPasas denominado Rho, a través de su interacción con actina. Al mismo tiempo que se generan las adhesiones focales en las proyecciones del frente celular, la parte trasera de la célula debe retraerse para permitir el movimiento celular. En este proceso también se encuentra implicada la proteína Rho, la cual debe ser inhibida en la parte trasera para desestabilizar las uniones de la célula al sustrato a la vez que ejerce su papel en la contracción del cuerpo celular mediante su interacción con la miosina (Ridley and Hall, 1992; Ridley and Hall, 1994; Chrzanowska-Wodnicka and Burridge, 1996). Las Rho GTPasas deben estar bien reguladas para poder ejercer de forma correcta su papel de reorganización del citoesqueleto de actina durante la migración celular. Las Rho GTPasas presentan dos estados conformacionales que dependen de su unión a GTP (activa) o a GDP (inactiva). La regulación de este ciclo de activación/inactivación va a depender de tres tipos de proteínas distintas: unas proteínas activadoras denominadas GEF del inglés Guanine Nucleotide Exchange Factor, las cuales catalizan la unión de las proteínas a GTP; unas proteínas inactivadoras GAP, que procede del inglés GTPase Activating Proteins, implicadas en la hidrólisis del GTP y la posterior unión de las Rho GTPasas a GDP; y unas proteínas inhibidoras de la disociación de nucleótidos de guanina, GDI del inglés Guanine Nucleotide Disociation Inhibitor, las cuales se mantienen unidas a las Rho GTPasas inhibiendo la asociación con el nucleótido de guanina previniendo así su activación (Kjoller and Hall, 1999). Los factores GEFs son los más estudiados respecto a la activación de las GTPasas. Los miembros pertenecientes a la familia de las RhoGEF se caracterizan por poseer el complejo DH-PH, que interviene tanto en la localización de las RhoGEFs en la membrana plasmática como en la regulación la actividad catalítica (revisado en Rossman et al., 2005). Cabe destacar el GEF Vav por ser una proteína que contiene un bucle de autoinhibición situado en el extremo amino-terminal que regula negativamente al dominio catalítico DH, bloqueando así la accesibilidad a las Rho GTPasas (Schmidt and Hall, 2002). Además, esta proteína contiene los dominios SH2-SH3-SH2 en su extremo carboxi-terminal, por el cual se activa mediante fosforilación (Bishop and Hall, 2000). Vav ha sido situado corriente abajo de algunos receptores tirosina kinasas. Tras la estimulación de estos receptores, Vav es fosforilado, lo que produce la estimulación del dominio catalítico DH, pudiendo así interaccionar con las Rho GTPasas (Garrett et al., 2007). Concretamente, se ha implicado en la regulación de la proteína Rac1 y se ha establecido su papel en migración celular principalmente en células en cultivo, donde se ha mostrado que mutaciones de vav pueden generar una disminución de la activación de Rac1 impidiendo así la migración en células en cultivo (Citterio et al., 2012; Lin et al., 2012). En resumen, los receptores tirosina kinasas juegan un papel fundamental en la migración celular dirigida, ya que su activación por señales externas, activan una cascada de señalización que a través de GEFs y Rho GTPasas controlan la reorganización del citoesqueleto y por tanto la migración celular. Los mecanismos moleculares por los cuales las Rho GTPasas y sus activadores, los GEFs, regulan la migración celular han sido mayormente descritos in vitro o in vivo mediante experimentos en cultivos celulares. Por ello, poco se sabe de su función en situaciones fisiológicas en el contexto de un organismo vivo. En esta tesis utilizaremos como modelo de migración las células del borde del ovario de Drosophila melanogaster para tratar de descifrar in vivo el papel de estas proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina durante procesos de migración celular que tienen lugar durante el desarrollo. El sistema reproductivo de la hembra adulta de Drosophila melanogaster está compuesto por dos ovarios situados en el abdomen. Cada ovario tiene aproximadamente entre 16 y 20 ovariolas, conteniendo cada una de ellas una hilera de 14 cámaras huevo en distintos estadios del desarrollo. Las cámaras huevo están formadas por 15 células nutricias y un oocito que proceden de la línea germinal. Rodeando a la cámara huevo se encuentran las células foliculares, las cuales proceden de la línea somática. En ambos extremos de la cámara huevo se localizan un par de células foliculares especializadas denominadas células polares. En el estadio 8 del desarrollo, las células polares anteriores reclutan a 4-6 células foliculares vecinas formando así el grupo de las células del borde (BCs). Las células del borde migrarán de forma colectiva a través de las células nutricias hasta contactar con el oocito situado en la parte posterior de la cámara huevo en el estadio 10. La migración de las células del borde se asemeja a una transición epitelio-mesénquima, ya que, en este proceso las células foliculares pierden su polaridad epitelial excepto las dos células polares que quedarán situadas en el centro del grupo. Además, en el grupo de las BCs queda establecida una asimetría entre el frente del grupo y la parte de atrás. En este frente de migración es donde se acumula de forma preferencial la F-actina y donde tiene lugar la formación de la mayoría de las extensiones de membrana necesarias para el movimiento del grupo hacia el oocito (Montell, 2003). En esta reorganización de actina está implicada la Rho GTPasa Rac1, de manera que la falta de expresión de Rac1 resulta en defectos en la migración. Además, mediante la técnica de FRET se ha observado que existe una asimetría en la activación de Rac1, siendo ésta mayor en el frente de las BCs (Wang et al., 2010). Esto mismo se observó con la disminución de la expresión de PVR o EGFR en las BCs. Además, la disminución de la activación Rac1 afecta a la localización de las proyecciones en el frente del grupo. Todos estos datos concluyeron que EGFR y PVR activaban a Rac1 en el frente de las BCs dirigiendo así la migración hacia el oocito (Duchek and Rorth, 2001; Duchek et al., 2001; McDonald et al., 2003; Wang et al., 2010). A pesar de ello, se desconoce el mecanismo molecular por el cual tiene lugar este proceso. Por este motivo, en este trabajo hemos estudiado el papel de Coracle en la migración de las BCs ya que se trata de una proteína que interacciona con el citoesqueleto de actina y, recientemente, se ha implicado en la migración en células en cultivo. Además, hemos caracterizado la función de genes candidatos que surgieron en un estudio previo realizado en el laboratorio de la Dra. Pernille Rorth, donde se identificaron aquellos genes que interaccionaban físicamente con los receptores EGFR y PVR mediante la técnica de doble híbrido en levaduras. Como hemos descrito anteriormente, la migración de las BCs, como cualquier migración celular, es un proceso multi-etapa que requiere de una reorganización del citoesqueleto de actina, de cambios en la adhesión celular y de una redistribución de la polaridad celular. Por ello, para la caracterización de las funciones de los genes candidatos se analizaron estos tres aspectos de la migración tras disminuir los niveles de dichos genes en las BCs. Así, se analizó: la reorganización del citoesqueleto de actina, los cambios en la adhesión celular mediante la observación de los niveles de cadherinas y los cambios en la polaridad celular, mediante el análisis de la localización de la proteína de polaridad Discs large (Dlg). El primero de los genes candidatos estudiados fue coracle. Coracle es el homólogo en Drosophila de la proteína 4.1 de mamíferos, una proteína implicada en la reorganización del citoesqueleto de actina y en polaridad celular. Se observó que Coracle se localizaba de forma específica en las células polares anteriores durante todo el proceso de migración de las BCs, desde el estadio 8 hasta el 10. Además, parecía localizarse en la región apico-lateral de las mismas. Finalmente, se observó que deficiencias en la expresión de Coracle producían una redistribución de la actina durante la migración de las BCs. Sin embargo, no se observó ningún cambio en la expresión de cadherinas o Dlg. De entre los genes candidatos surgidos a partir del doble híbrido obtuvimos fenotipos en la migración de las BCs, cuando se reducía la expresión de CG2887, CG33993 y vav. El porcentaje de BCs que mostraban un retraso en la migración variaba en función del gen mutado, obteniéndose fenotipo en un 29% de BCs deficientes para CG2887, en un 56% para CG3393 y en un 34% para vav. Además, se observó una disminución de los niveles de actina en BCs tras inhibir la expresión de cada uno de los tres genes de forma individual. Con respecto a la polaridad celular, se observó que en BCs con deficiencias en la expresión de CG22887 y CG33993, se producía una disminución de la expresión de Dlg. Sin embargo, deficiencias en el gen vav, no alteraban la expresión de Dlg con respecto a la situación control. Finalmente, se observó que en ninguno de los tres casos se alteraba la expresión de las cadherinas. Estos resultados sugieren que los genes CG2887, CG33993 y vav son necesarios para la correcta migración de las BCs y que su función podría estar relacionada con la regulación del citoesqueleto de actina. Además, CG2887 y CG33993 podrían estar implicados en la regulación de la proteína de polaridad celular Dlg. Datos previos de otros laboratorios obtenidos con células en cultivo, ya habían implicado a Vav en migración celular y se había demostrado que en algunos contextos celulares Vav actuaba de enlace entre los RTKs y el citoesqueleto de actina. Por tanto, decidimos enfocar el resto del trabajo de tesis en el estudio de Vav como candidato ideal para actuar corriente abajo de los RTKs durante el proceso de la migración de las BCs. Por ello, se analizó en profundidad los mecanismos moleculares y celulares por los cuales Vav regulaba la migración de las BCs. En este trabajo mostramos que Vav se localiza en las proyecciones de las BCs y que su localización parece estar regulada durante las distintas fases de la migración. Además, se observó que deficiencias en la expresión de Vav producían una distribución alterada de las proyecciones durante la migración, aumentando el número y vida media de las mismas en el frente. Estos hallazgos demuestran que Vav se requiere para la correcta distribución de las proyecciones así como para la estabilidad y longitud de las proyecciones del frente. Este papel debía tener implicaciones tanto en la velocidad como en la trayectoria de la migración de las BCs. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos donde se observó que deficiencias en la expresión de vav producían una disminución de la velocidad de migración y una trayectoria alterada no lineal en contraste con la velocidad normal y trayectoria lineal de las BCs control. Estos resultados nos permiten concluir que Vav tiene un papel en el mantenimiento de la trayectoria hacia el oocito. Paralelamente, se observó que la sobreactivación de Vav en las BCs resultaba en un fenotipo de falta de migración similar al producido por la sobreactivación de Rac1. Además, en colaboración con el laboratorio del Dr. Gregory Emery se analizó el papel de Vav como Rac1-GEF en las BCs. Se observó que deficiencias en la expresión de Vav producían un descenso de la activación de Rac1 en el frente del grupo de las BCs. Estos datos sugieren que Vav participa en la misma ruta que Rac1 y además actúa como Rac1-GEF preferentemente en el frente de las BCs. Además, se observó que Vav interaccionaba genéticamente con los receptores EGFR y PVF. Por un lado, observamos que la falta de expresión de vav y egfr de forma individual producían fenotipos de migración algo menores que con la eliminación de los dos genes a la vez. Por otro lado, observamos que la falta de expresión de vav y pvr de forma individual producían fenotipos de migración mucho menores que con la eliminación de los dos genes a la vez. Este resultado era similar al obtenido con la falta de ambos receptores observado en estudios previos. Estos resultados junto con los obtenidos a partir de células de Drosophila en cultivo donde se observó que PVR y EGFR activan a Vav mediante fosforilación, sugieren que Vav podría estar actuando corriente abajo de EGFR y PVR interaccionando quizás con una tercera proteína. Por ello, se analizó la interacción genética entre Vav y otros GEFs como el complejo ELMO/Mbc y Trio ya que se trata de proteínas implicadas en la activación de Rac1. En este estudio se observó que la disminución de la expresión de Vav junto con ELMO/Mbc y Trio, producía un aumento del retraso de migración si lo comparamos a cuando se disminuían de forma individual. Lo cual sugiere que Vav, ELMO/Mbc y Trio podrían estar colaborando en las mismas rutas de señalización. Estos resultados en conjunto nos permiten proponer un modelo de trabajo por el que, una vez que los receptores EGFR y PVR se activan en el frente del grupo de las BCs, reclutan a Vav activándolo y éste, a su vez, activará a Rac1 en el frente generando las proyecciones necesarias para la migración. Además, en esta ruta podrían estar colaborando corriente abajo de EGFR y PVR las proteínas ELMO/Mbc y Trio probablemente como proteínas adaptadoras de la ruta. En resumen, en este trabajo hemos descrito un nuevo papel en la migración de las BCs para la proteína de citoesqueleto Coracle. Además hemos identificado a CG2287, CG33993 como nuevos genes implicados en este proceso, que deben ser caracterizados en profundidad en el futuro. Por otro lado hemos identificado un nuevo papel del GEF vav en la migración de las células del borde. Además, describimos el mecanismo molecular por el cual Vav actúa como intermediario de las rutas de los receptores tirosina kinasas EGFR y PVR, actuando corriente abajo de estos y activando a Rac1 en el frente de las BCs.