Desarrollo de protocolos de expansión de la masa de células beta a partir de islotes de Langerhans adultos

Resumen

RESUMEN DEL PROYECTO #DESARROLLO DE PROTOCOLOS DE EXPANSIÓN DE LA MASA DE CÉLULAS ß A PARTIR DE ISLOTES PANCREÁTICOS ADULTOS# INTRODUCCIÓN La diabetes mellitus es un grupo de trastornos metabólicos que afecta a 250 millones de personas en todo el mundo y que en las últimas décadas está alcanzando niveles de epidemia, con especial incidencia en las sociedades desarrolladas y en vías de desarrollo. Se diferencian dos tipos principales: diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2. La diabetes tipo 1 se debe a la destrucción autoinmune de las células ß pancreáticas, lo que resulta en una deficiencia absoluta en la producción de insulina. Los pacientes con diabetes tipo 1 deben tomar insulina exógena para regular sus niveles de glucemia. Su frecuencia es relativamente baja comparado con la diabetes tipo 2. Del total de personas afectadas con diabetes el 90-95 % presentan diabetes tipo 2. La diabetes tipo 2 se origina como consecuencia de la resistencia a la insulina por parte de los tejidos periféricos, además de una secreción de insulina anormal. Los pacientes con diabetes tipo 2 no son dependientes de insulina exógena, pero la pueden requerir en caso de que una dieta regulada o agentes hipoglucemiantes no consigan un buen control de los niveles de glucosa. En ambos casos, la deficiencia de insulina, ya sea absoluta (diabetes tipo 1) o relativa (diabetes tipo 2), impide que la glucosa pueda ser incorporada de manera eficiente por los tejidos y se acumula en la sangre. El resultado es un estado de hiperglucemia origen de numerosas complicaciones vasculares como neuropatía, nefropatía, retinopatía, etc. La célula ß es la única célula del organismo capaz de expresar, procesar y secretar insulina de manera pulsátil y regulada en respuesta a continuas variaciones en la concentración de los nutrientes circulantes, principalmente la glucosa. La complejidad y sofisticación de este sistema hace que sea muy difícil, por no decir imposible, reproducir su fisiología. La terapia celular, es decir el reemplazo de las células ß, supone la opción terapéutica más cercana a la cura de la diabetes. El protocolo de Edmonton desarrollado en el año 2000 logró un éxito razonable del trasplante de islotes procedentes de donantes cadavéricos. A pesar de ser un gran avance, esta aproximación terapéutica tiene que hacer frente a numerosos retos, principalmente al enorme déficit entre tejido trasplantable y el número de pacientes diabéticos, que además va en aumento. Así, en los últimos años una gran cantidad de investigaciones tienen como objetivo el desarrollo de métodos y estrategias para aumentar la disponibilidad de células ß o de sustitutos de células ß que potencialmente se puedan trasplantar en pacientes diabéticos. Para ello es importante conocer los mecanismos por los cuales se forman nuevas células ß en el organismo. Durante el desarrollo embrionario, las células ß se forman a partir de células progenitoras que expresan neurogenina 3. Sin embargo, parece que durante la vida normal adulta el mecanismo principal es la proliferación de células ß preexistentes más que la neogénesis a partir de células troncales pluripotentes. OBJETIVOS En este contexto de la terapia celular el objetivo de nuestro trabajo es la investigación de nuevas fuentes de células productoras de insulina a partir de tejidos adultos (islotes pancreáticos). De manera más concreta este objetivo puede subdividirse en dos: i) el estudio de la capacidad de expansión de las células ß in vitro y ii) la búsqueda de progenitores en los tejidos adultos capaces de diferenciarse hacia células endocrinas. Para ello se realizó un diseño experimental consistente en el cultivo de islotes de Langerhans en un medio suplementado con suero, una alta concentración de glucosa y LIF. Este medio se utiliza habitualmente para mantener el estado proliferativo y pluripotente de líneas de células troncales embrionarias. Se ha utilizado en este trabajo con el objetivo de promover la expansión de las células ß y de buscar o favorecer la aparición de células progenitoras en los islotes. RESULTADOS Los resultados revelan que las condiciones de cultivo inducen en los islotes pancreáticos la aparición de dos subpoblaciones celulares de interés, que podrían ser utilizadas como fuente potencial de nuevas células ß. Por un lado se observa a partir del día 3 de cultivo cómo empiezan a aparecer células con morfología mesenquimal (similares a fibroblastos) que tienden a formar una monocapa durante los 14 días de cultivo. Los resultados parecen indicar que estas células se forman a partir de las células ß pancreáticas mediante un proceso de desdiferenciación, si bien no se puede descartar la contribución de progenitores preexistentes en las preparaciones de los islotes. Lo más interesante es que estas células presentan una alta tasa de proliferación y que el proceso de desdiferenciación se ha mostrado reversible de manera que las células similares a fibroblastos, tras un cambio en las condiciones de cultivo, son capaces de diferenciarse hacia células que expresan el gen de la insulina y de recuperar el fenotipo epitelial propio de las células de los islotes. Por otro lado las condiciones de cultivo favorecen la aparición de células con marcadores de células progenitoras (que expresan Ngn3), logrando así otro de nuestros objetivos que era la búsqueda de progenitores en los islotes pancreáticos adultos. Además, el proceso de desdiferenciación va acompañado de un aumento en la proliferación de la población celular en cultivo. Estudios previos de expansión in vitro de islotes de Langerhans han demostrado que el aumento en la tasa de proliferación va ligado a una pérdida de la función propia de las células adultas. Con vistas a la terapia de reemplazo para pacientes diabéticos es importante que la célula ß mantenga sus funciones principales que son la síntesis y la liberación de insulina de una manera regulada. Por esta razón se evaluó la capacidad funcional de los islotes en cultivo. Los resultados muestran que siguen siendo funcionales en lo que respecta a su capacidad de secretar insulina en respuesta a concentraciones crecientes de glucosa, y a secretagogos específicos, así como a su capacidad de contener insulina. Esto indica que el proceso de desdiferenciación de la población celular de los islotes no afecta a la capacidad total del islote de responder, liberando insulina en presencia de nutrientes. Por último se evaluó la supervivencia de la población celular de los islotes cuando se cultivan en el medio suplementado. Los resultados indican que las condiciones de cultivo no inducen apoptosis significativa en la población celular. Además se sabe que cuando se induce a las células a expandirse in vitro, éstas experimentan un proceso de envejecimiento celular denominado senescencia. Este proceso no está ocurriendo de manera significativa en la población celular que prolifera en nuestro cultivo de islotes. CONCLUSIONES En resumen, se ha desarrollado un protocolo que permite la expansión in vitro de la población celular de los islotes manteniendo su capacidad funcional, y que por otro lado favorece la aparición de células con características de células progenitoras. Además estos resultados abren una puerta para investigar la capacidad de estas células como fuente de células productoras de insulina potencialmente trasplantables. Hay que tener en cuenta que la producción de cantidades relevantes de islotes funcionales a partir del páncreas adulto in vitro requerirá superar numerosos obstáculos. Sin embargo, el desarrollo de protocolos en este sentido no sólo puede suponer un método para generar islotes para trasplante, sino que además representa una herramienta útil para investigar los mecanismos de generación de nuevas células ß en el páncreas.