Identification and functional validation of genomic boundaries in mammals

Resumen

Los genomas de eucariotas están divididos en dominios de expresión, que se definen como aquellas porciones del genoma que contienen uno o varios genes y todos los elementos reguladores necesarios para que que se expresen de acuerdo con un patrón espacio-temporal concreto. Los aisladores genómicos, también llamados insulators, flanquean estos dominios y los protegen de la influencia no deseada de los elementos reguladores contenidos en los dominios vecinos. Existen diversos mechanismos de aislamiento, por lo que los insulators no se definen por una secuencia de ADN concreta, sino porque comparten una misma función. Así, para encontrar aisladores en el genoma de mamíferos de una forma no sesgada, nos propusimos identificar aquellas posiciones del genoma donde se requiere la presencia de función aisladora para satisfacer un problema biológico. Por ejemplo, genes adyacentes con perfiles de expresión completamente distintos deberían estar separados por aisladores que mantuviesen dominios de expresión independientes. Asimismo, cabe esperar la presencia de aisladores entre dominios silentes de heterocromatina y dominios activos de eucromatina. Aquí, impedirían los efectos perjudiciales que el avance de los primeros tendrían sobre los segundos. Finalmente, también podrían encontrarse aisladores flanqueando grupos de genes co-expresados para asegurar su co-regulación y, por tanto, co-expresión. Basándonos en estos escenarios, se desarrollaron diversos algoritmos que usaban datos de expresión génica para predecir la presencia de aisladores. Como resultado de estos algoritmos, se obtuvo una serie de secuencias conservadas evolutivamente y no codificantes que se validaron funcionalmente empleando varios tests. La capacidad de bloqueo de enhancers se evaluó mediante ensayos in vitro en células humanas en cultivo primero, y luego in vivo mediante el uso de peces cebra transgénicos. Además, se analizó la capacidad de uno de los elementos más potentes para proteger de efectos de posición cromosomales en ratones transgénicos. La descripción y caracterización de nuevos aisladores genómicos no sólo sirve para entender mejor cómo se organizan los genomas de mamíferos. También es útil para ampliar el abanico de herramientas disponibles que se pueden usar en construcciones heterólogas para bloquear los efectos de posición cromosomales que se dan comúnmente en experimentos de transferencia genética. Eukaryotic genomes are divided into expression domains, which contain DNA coding sequences together with all the regulatory elements needed for their correct spatio-temporal expression pattern. Genomic boundaries, also known as insulators, flank these domains preventing undesirable crosstalk between the regulatory elements of neighboring domains. They employ various mechanisms and thus, are functionally rather than structurally defined. For this reason, in an attempt to find boundaries in a genome-wide unbiased fashion in mammals, we focused on identifying those loci where the presence of boundary function would be required to satisfy a biological need. For example, we hypothesized that adjacent genes with opposite expression patterns would need to be separated by boundaries to maintain the independency of their different expression domains. Also, boundaries could be found partitioning the chromatin into inactive heterochromatic and active euchromatic domains, impeding the deleterious effects the spread of the former would have on the latter. Finally, boundaries could also bracket clusters of co-expressed genes to ensure their co-regulation and co-expression. Different algorithms, based on the analysis of gene expression data, were developed in order to explore these scenarios. The resulting evolutionarily conserved non-coding putative insulator sequences were functionally validated using a number of assays. Their enhancer-blocking properties were evaluated in vitro in human cells in culture, and then in vivo by using transgenic zebrafish. Additionally, one of the most powerful elements was further tested for its ability to protect from chromosomal position effects in transgenic mice. The description and characterization of new genomic boundaries would shed some light into the way mammalian genomes are organized, as well as expand the repertoire of genetic tools that can be incorporated in heterologous constructs to improve the gene transfer technologies by preventing chromosomal position effects.