Modificacion genética de celulas somáticas para la integración dirigida de transgenes en sitios permisivos pre-seleccionados

Zusammenfassung

La capacidad de modificar el genoma de los animales de manera precisa es fundamental para el desarrollo de nuevas aplicaciones de la transgénesis en Biotecnología Animal, Ganadería y Biomedicina. La expresión específica de un transgén está fuertemente influenciada por el lugar de integración en el genoma de la célula receptora. Estos "efectos de posición" asociados al lugar de integración sugieren que existen sitios en el genoma más permisivos que otros para la expresión de transgenes. Aunque hay algunos ejemplos de loci permisivos en genes murinos y humanos, apenas se han realizado estudios sistemáticos para su identificación. Dichos estudios implican el diseño de un sistema in vitro que permita, en primer lugar, analizar la correcta regulación y expresión de un transgén integrado en diferentes localizaciones del genoma y, en segundo lugar, integrar otros transgenes en esas mismas regiones genómicas. Esta Tesis Doctoral se planteó con el objetivo de desarrollar un sistema de las características mencionadas, y establecer una línea de células somáticas murinas, modificadas genéticamente, que pudiera utilizarse como herramienta para la integración dirigida de genes de interés y la correcta expresión de los mismos. En primer lugar se diseñó y se generó una construcción, a la que se denominó "locus artificial" (vector pAL), en el que se incluyeron: (a) un promotor constitutivo eficiente (promotor humano del gen del factor de elongación 1 alfa); (b), un sistema reporter regulado por un promotor específico de tejido (promotor porcino del gen de la cadena pesada de miosina dirigiendo la expresión del gen de la proteína verde fluorescente GFP), y (c) secuencias que pudieran actuar como regiones de homología en experimentos de recombinación homóloga (dos secuencias intrónicas de genes murinos). Una vez construido el vector pAL, se procedió a electroporarlo en las células murinas C2C12, con el fin de generar clones que, aleatoriamente, hubieran integrado el "locus artificial" en diferentes regiones del genoma. Posteriormente, se evaluó el patrón de expresión de GFP en las células al inducir la diferenciación miogénica. La selección de los clones celulares se realizó tomando como criterio la activación transcripcional del promotor específico de tejido, es decir, la expresión de GFP en las células diferenciadas formando miotubos. El porcentaje promedio de clones en los que el "locus artificial" se integró en sitios potencialmente permisivos fue del 11,4%, valor que estuvo en consonancia con datos de otros autores. En estos clones se comprobó que el patrón de expresión del transgén era específico, su regulación apropiada y que, por tanto, el sitio de integración podía calificarse de "permisivo". Finalmente, se probó la utilidad del modelo desarrollado para conseguir la integración dirigida de otro transgén en el "locus artificial" mediante recombinación homóloga (gene targeting). Para este objetivo, se diseñó un vector de gene targeting (pGTV) de reemplazamiento, y se aplicó una estrategia de selección del tipo "promoter trap". El factor de enriquecimiento en clones potencialmente recombinantes fue de 24x y la eficiencia de "gene targeting" fue de 1,76%, valor comparable al de otros experimentos llevados a cabo con células somáticas en animales domésticos. Por tanto, el sistema desarrollado demostró ser una herramienta válida para la modificación genética dirigida de células somáticas murinas, y podría ser aplicable en células somáticas de animales de granja utilizadas en transferencia nuclear.