Desarrollo de métodos miniaturizados de preparación de muestras para el estudio de diversos analitos en diferentes matrices

Resumen

INTRODUCCIÓN Una de los pasos más importantes en el procedimiento analítico es la etapa de preparación de muestra. La mayoría de los análisis se llevan a cabo en muestras que contienen una mezcla compleja de compuestos químicos en cantidades traza y ultratraza que necesitan ser identificados y cuantificados. Al mismo tiempo, la mayoría de las matrices ambientales, tales como suelos, material vegetal o aguas residuales son igualmente muy complejas. De este modo un método común y exitoso de preparación de muestra tiene que acometer tres grandes objetivos: (1) simplificación y/o reemplazo de la matriz (2) enriquecimiento del analíto y (3) limpieza de la muestra[1,2]. Además se requiere una constante búsqueda para la mejora de los procedimientos de preparación de muestra que persiga los siguientes propósitos: (1) reducción en el número de pasos requeridos para el procedimiento, (2) adaptación al campo de muestreo, (3) automatización y (4) reducción o eliminación total del uso de disolventes requeridos para la extracción[3-5] y todo esto en consonancia con las tendencias actuales en Química Analítica y teniendo en cuenta la ideología de la Química Verde. En ese sentido y en atención a las actuales tendencias en los procesos de preparación de muestra, las técnicas de microextracción sin solvente y las técnicas de preparación de muestra miniaturizadas han venido ganando mucho terreno, porque cumplen completamente con los objetivos y propósitos establecidos anteriormente[6-14]. En especial cuando el tipo de matriz a estudiar plantea varios retos analíticos, como es el caso del uso de bioindicadores para el seguimiento de la contaminación atmosférica. El uso de bioindicadores de contaminación (e.g. líquenes, musgos, hojas de pino) es una técnica complementaria ventajosa en el seguimiento de la contaminación del aire, ya que proporciona información adicional y útil sobre la zona, que no se consigue fácilmente con el análisis convencional[10-12,15,16]. Los bioindicadores son organismos que responden a un cierto nivel de contaminación, cambiando su comportamiento natural o por acumulación del contaminante en sus tejidos. La ventaja del uso de bioindicadores es la toma de muestras, fácil incluso en zonas alejadas y de difícil acceso, sin necesidad de instrumentación para el muestreo, pues en estas zonas remotas no hay posibilidad de instalación de captadores[12]. Por otro lado, proporcionan la medida de contaminación en un periodo de tiempo, pero en general no son capaces de responder a medidas puntuales. Por tanto se pueden considerar complementarios de una medida puntual. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs) constituyen una clase de contaminantes atmosféricos formados por dos o más anillos aromáticos condensados. Estos se forman durante la combustión incompleta de combustibles y las mayores fuentes de emisión a la atmosfera están principalmente relacionadas con las actividades humanas, tales como la combustión de carbón, fuel y madera en hogares[17] y el tráfico rodado. Este grupo de compuestos representa riesgos potenciales para la salud por los efectos mutagénicos y carcinogénicos generados por la mayoría de ellos, y por ello se consideran contaminantes prioritarios. Dada su toxicidad, el interés por la presencia y procedencia de estos contaminantes en áreas remotas es de gran importancia[18]. Si bien el análisis de los PAHs en diferentes matrices, incluidas matrices ambientales, y varios bioindicadores como musgos, líquenes y material vegetal, está muy estudiado, no se puede decir lo mismo de los compuestos relacionados con ellos, como los nitro-PAHs y los oxo-PAHs. Ambas familias se generan por distintas vías a partir de los PAHs. Su baja concentración por un lado y por otro las dificultades para su análisis han hecho que haya muy pocos trabajos en los que se determinan estos compuestos. Sin embargo, su análisis puede completar la información ambiental obtenida. Además, su toxicidad es alta, por lo que se considera de gran importancia disponer de datos relativos a los nitro-PAHs y los oxo-PAHs. Hasta el momento existen sólo algunos trabajos de otros autores que han analizado simultáneamente dos de las tres familias propuestas: nitroPAHs y oxoPAHs[13] ó PAHs y nitroPAHs[15]. Los métodos de extracción y limpieza para la determinación de PAHs en material vegetal más habituales son: extracción soxhlet y limpieza en columna SPE de sílica[19] ó extracción en Soxhlet seguida de limpieza con SPEflorisil[20,21]; extracción presurizada con disolvente (PLE) seguida de SPEsílice[20]; extracción con ultrasonidos (USE) previa extracción líquido-líquido (LLE) seguido de limpieza en columna SPE de alúmina[22] ó LLE+USE+CCsílice[23]; USE+SPEalúmina[20]; USE+SPEsílice[24,25]; USE+SPEflorisil_desactivado+SPEflorisil_activado[26,27] ó USE+ microextracción en fase líquida HF-LPME[28]; extracción acelerada con disolvente (ASE) seguida de limpieza con SEC (size exclusión chromatography)[29]; ASE+SPEflorisil desactivado[27,29]; ó ASE+MPLC (automated medium pressure liquid chromatography)[30]; extracción asistida con microndas (MAE) seguida de SPEflorisil_alumina[21]; extracción con fluido supercrítico SFE[31]; extracción dinámica con disolvente asistida con ultrasonido (DSASE) seguida de limpieza con SPEamino[10-12,15,32] En la mayoría de los casos anteriores los sistemas de detección y análisis utilizados para este tipo de compuestos orgánicos persistentes una vez extraídos de sus complejas matrices a saber: agujas de pino[18,20,24-31,33]; hojas de árboles caducifolios[29]; musgos[10-12,15,16,18,22,23,27,29,34]; hojas de maíz y arce[25]; hierbas y muestras silvestres[21]; líquenes[10-12,18,19,32]; hojas de material vegetal[35]; fueron GC-ECD[21,36]; GC-NPD[36]; GC-TID[36]; GC-CLD detector de quimioluminiscencia[36]; GC-MS[20,23,29-31]; GC-MS modo SIM[10-12,18,20,25-27]; APGC-Q-TOFMS[15]; LC-MS[36]; HPLC-UV[19,22,37-39]; HPLC-CD detector de quimioluminiscencia[36,37,39]; HPLC fluorescencia[24,33,35-37,39]; HPLC-ED[36]detector electroquímico. Aunque los desarrollos modernos pueden sugerir el uso de MS[36,39] como detector para mejorar la sensibilidad, en especial si el reto es la detección simultánea de las tres familias de contaminantes prioritarios a saber PAHs, nitro-PAHs y oxo-PAHs, es importante proporcionar tratamientos de muestra que faciliten el análisis y aumenten la sensibilidad de la determinación, y que además alcancen los propósitos arriba expuestos frente a las nuevas tendencias en la preparación de muestras como los métodos miniaturizados propuestos en este proyecto. Como aportación significativa este trabajo proyecta estudiar la concentración de PAHs, nitro-PAHs y oxo-PAHs así como metales traza[40,41] en el sistema natural del Himalaya a través del establecimiento de patrones de distribución, correlaciones de PAHs y elementos traza e identificación de posibles fuentes de estos compuestos y los metales en el ambiente atmosférico. El análisis de metales se llevará a cabo mediante dos estrategias: a) análisis de elementos del grupo del platino[42,43] y b) por las diferencias de composición isotópica de plomo y talio[44,45]. Aunque no se han encontrado aún correlaciones estadísticas significativas entre las concentraciones de PAHs y elementos traza en un estudio de los patrones de distribución de estos contaminantes en musgos de diferentes bosques del centro y sur de Polonia, se encontraron algunas correlaciones positivas entre los elementos que no son los más esenciales en la bioquímica de las plantas[46], o con el volumen de tráfico y no con la cantidad de población de los sitios evaluados[22]. Algunos estudios[17,18] establecen que la mayoría de los PAHs y los elementos examinados parecen ser de origen antropogénico, en especial en esta región donde parte de las emisiones provienen de la combustión doméstica[17]. La única excepción es el patrón de distribución de los elementos traza en una parte de la zona de estudio, que está vinculado a la anomalía geoquímica de rocas locales. Debe destacarse que el Grupo de investigación en el que se enmarca esta Tesis ha establecido una colaboración científica con el Departamento de Botánica del Pt.L.M.SGovt. P. G College (HNB Garhwal Central University) para evaluar los PAHs, nitro-PAHs y oxo-PAHs en la región del Himalaya. Por otro lado, los contaminantes orgánicos emergentes como es el caso de los residuos de productos farmacéuticos y de cuidado personal PPCPs, son contaminantes cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la preocupación por las posibles consecuencias de la misma[47-49], que se ha convertido en los últimos años en línea prioritaria de investigación de entidades como la OMS, EPA, UE. Dado que estos compuestos son por un lado poco o nada investigados y por el otro no regulados hay una escasez de datos ambientales y falta de métodos analíticos para su seguimiento. Su introducción en el medio ambiente es continua debido a la elevada producción y consumo y no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos. En esta categoría se encuentran también los subproductos de la desinfección del agua potable, productos para la higiene personal y los biocidas . El uso de biocidas tales como triclosan, isotiazolinonas, etc está presente en un amplio rango de productos de consumo diario, incluyendo jabones y muchos otros productos[6,50,51]. Algunos estudios con animales de laboratorio han mostrado que estos biocidas pueden alterar la regulación hormonal o causar resistencia a antibióticos[49]. Basado en su toxicidad la Unión Europea UE reglamentó hace unos pocos años la eliminación de triclosán en materiales de envase alimentario[52]. Sin embargo está aún presente en muchos productos de consumo diario y consecuentemente también estará presente en el ambiente[48]. De este modo el análisis de estos compuestos se requiere a diferentes niveles de concentración, incluyendo niveles traza y ultratraza. Ente los métodos más efectivos para su análisis se incluyen RP-HPLC[50], UHPLC-MS[50,53] and GC-MS con derivatization previa[47,49]. Finalmente una parte de esta investigación pretenderá demostrar como se dijo antes que la elección de un buen método de preparación de muestra sea suficiente para alcanzar los niveles de sensibilidad requeridos de manera que los métodos de detección tipo HPLC-UV convencionales pueden ser suficientes para el propósito si se aplica una técnica de microextracción apropiada. Estas técnicas son baratas, fáciles de usar y disponibles en cada laboratorio. Por lo tanto, es un asunto de tratamiento de la muestra más que una mejora basada en la sensibilidad del detector. Y en esto se centra parte de esta investigación, al buscar a través de un procedimiento de preparación de muestra adecuado, mejorar los niveles de detección de este tipo de contaminantes orgánicos conocidos como contaminantes emergentes a través del enriquecimiento del analito, de manera que se consiga aumentar la sensibilidad del método y sea posible la utilización de métodos de detección convencionales para su análisis[39]. DESARROLLO TEÓRICO El desarrollo teórico de la tesis doctoral implicó el uso de la siguiente metodología: 1. Determinación de halometanos en agua potable por GC-ECD con preparación de muestra tipo microextracción en fase líquida usando membrana porosa HF-LPME en dos fases y su comparativa frente a extracción en HS y detección por GC-MS y HS-SPME-GC-ECD Se desarrollarán y optimizarán tres diferentes técnicas de preparación de muestra sin uso de disolvente basadas en microextracción, extracción con membrana y extracción en espacio de cabeza para la determinación de trihalometanos en agua potable por GC-ECD (detector de captura de electrones) y detección con espectrometría de masas (MS). Las técnicas empleadas serán microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (HS-SPME), microextraction en fase líquida con membrana (HF-LPME) y extracción en modo espacio de cabeza (HS). Todas las técnicas a utilizar serán optimizadas con diferentes diseños de experimentos para seleccionar las variables más relevantes que afecten significativamente los diferentes procesos. 2. Determinación de biocidas en productos cosméticos, adhesivos y simulantes de migración por HPLC-UV con preparación de muestra tipo microextracción en fase líquida usando membrana porosa HF-LPME en tres fases: 2.1 Triclosan en producto cosmético y simulantes de migración a parir de RPET mediante HPLC-UV con una confirmación de resultados usando UHPLC-MS Se ensayarán tres técnicas diferentes de microextracción con disolvente para seleccionar la que ofrezca las mejores características analíticas para la cuantificación de triclosan en diferentes aplicaciones. Los métodos de microextracción estudiados serán: a) microextracción dispersiva líquido-líquido con líquidos iónicos; b) microextracción con electromembrana y c) microextracción líquida en tres fases con membrana HF-LPME. El análisis final se llevará a cabo por RP-HPLC-UV. 2.2 Isotiazolinonas en adhesivos de uso en material alimentario mediante HPLC-UV con una confirmación de resultados usando UHPLC-Q-TOFMS Se desarrollará y optimizará un procedimiento de microextracción en fase líquida para mejorar la sensibilidad en la determinación de 2-metil-4-isotiazolin-3-ona (MIT) y 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona (CMIT) en adhesivos. El procedimiento involucra la microextracción en fase líquida tres fases HF-LPME usando una membrana semipermeable de polipropileno que se impregnará con 1-octanol como fase orgánica. Las fases donora y aceptora son medios acuosos ácidos y alcalinos respectivamente. Este último será analizado por HPLC-UV. 3. Determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos PAHs y sus derivados (nitro y oxo PAHs) en líquenes del Himalaya por GC-MS en modos impacto electrónico e ionización química respectivamente con preparación de muestra usando extracción dinámica con solvente DSASE seguida de SPE y confirmación de resultados mediante análisis simultáneo por APGC-Q-TOFMS Evaluación analítica de 45 muestras de líquenes como biomonitores de la contaminación atmosférica recogidas en el Ecosistema Natural del Himalaya y determinación de PAHs, nitroPAHs y oxoPAHs en cada una de las muestras. Para ello se desarrollará un método analítico que incluye la extracción, limpieza, enriquecimiento y análisis por triplicado de éstos compuestos en líquenes por GC-MS. 4. Determinación de metales pesados en líquenes del Himalaya por ICP-MS previa digestión de muestras asistida por horno microondas. Para este propósito se evaluarán las 45 muestras de líquenes (secas y molidas 0.1g ) y previa digestión ácida (1ml HNO3: 6mL H2O2) asistida por microondas, el extracto se llevará a sequedad y a volumen con 10 mL de HNO3 1%, todas las muestras previa digestión se doparán con 100 ¿L de solución estándar enriquecida de Cr53/Cr52. Antes de la lectura por ICP-MS se adicionará disolución estándar de Tl, que permitirá el seguimiento de la huella del plomo por la metodología de la dilución isotópica. 5. Aplicación de herramientas de análisis multivariante tipo MarkerLynx para el establecimiento de correlaciones estadísticas entre las concentraciones de PAHs y sus derivados oxidados y los elementos traza en líquenes del Himalaya. Se establecerán patrones de distribución que permitan indagar sobre el origen y rastreo de posibles fuentes de contaminación de PAHs y derivados así como de metales pesados (huella del plomo) Los patrones de agrupación y la construcción de la primera línea base de concentraciones de PAHs19 y derivados oxidados y elementos traza se construirá a partir de categorías como: especies de líquenes, tipos de sustratos, actividad antropogénica de la zona y usos de la tierra entre otras en las que se encuentran agrupadas las 45 muestras de líquenes. CONCLUSIONES Se pueden resaltar como conclusiones generales del trabajo desarrollado, las siguientes: 1. Se han estudiado y optimizado con éxito las siguientes técnicas de microextracción y tratamiento de muestra para una serie de matrices complejas muy diferentes. Todos los métodos desarrollados coinciden con las tendencias actuales de la química analítica verde, mostrando buenas características analíticas, pero insistiendo siempre en la idea de mejorar la sensibilidad del análisis. 2. Las mejores opciones en cada caso, entre todas las estudiadas, son: Determinación de trihalometanos en aguas: HFLPME + GC-MS Biocidas tipo isotiazolinonas en adhesivos: 3P-HFLPME (3 fases) + HPLC-UV Triclosan en cosméticos y plásticos: 3P-HFLPME (3 fases) + HPLC-UV PAHs, nitroPAHs, oxoPAHs en líquenes: DSASE + GC(CI)-MS(IT) DSASE + APGC-QTOFMS Elementos inorgánicos en líquenes: MW(digestión)+ ICP-MS 3. Las técnicas desarrolladas han sido validadas por comparación con otros procedimientos de análisis en cada caso, permitiendo de esta forma proponer dichas técnicas para su uso en la resolución de problemas similares: 3.1 Mediante el uso de técnicas de microextracción en fase líquida y sólida se han desarrollado métodos analíticamente fiables y válidos para la determinación de halometanos en aguas de consumo humano, que permiten hacer un seguimiento eficaz a la calidad el agua en las plantas potabilizadoras. 3.2 Mediante el uso de métodos de microextracción en fase líquida y en especial la HF-LPME, en modo tres fases con uso de membrana hueca, se ha desarrollado una metodología para la determinación de biocidas en adhesivos, productos cosméticos y simulantes de alimentos después de ensayos de migración, usando equipos de fácil adquisición en cualquier laboratorio de análisis como HPLC-UV. 3.3 A través del uso de un método de extracción dinámica con disolvente seguido de una limpieza con SPE, se ha evaluado analíticamente 45 muestras de líquenes con el análisis simultáneo de 31 contaminantes prioritarios entre PAHs, nitroPAHs y oxoPAHs, seguido de una detección en dos pasos, usando el sistema GC-MS trampa iónica. Esto permitirá evaluar las muestras como biomonitores de la contaminación atmosférica en el Ecosistema Natural del Himalaya. 3.4 Seguidamente se desarrolló un método de digestión ácida asistida por horno microondas para la determinación de elementos traza en los líquenes del Himalaya mediante ICP-MS. Se ha logrado la optimización del proceso de tratamiento de muestra de líquenes para la determinación de la concentración de 15 elementos traza por ICP-MS. A través de una doble estrategia de cuantificación: recta de calibración y dilución isotópica, se evaluaron las concentraciones de elementos traza, estableciéndose la línea base general de contaminación en la región de estudio. Con ayuda por un lado, de la huella isotópica del plomo y sus relaciones isotópicas más importantes; y de los factores de enriquecimiento EFs para cada metal, por otro lado, se pudo identificar las posibles fuentes emisoras del elemento plomo en la zona de estudio, y establecer la procedencia antropogénica o natural de cada uno de los elementos analizados 4. Finalmente se pudo estudiar el origen y las fuentes posibles de PAHs, subproductos de oxidación (nitroPAHs y oxoPAHs) y metales pesados en líquenes del Himalaya, sus interacciones e interrelaciones mediante el uso de herramientas de análisis multivariante. Se ha podido establecer correlaciones entre la identificación de las posibles fuentes y el estudio de diferentes patrones de distribución espacial y la evaluación de la consistencia química de PAHs, nitro-PAHs, oxo-PAHs y metales traza en líquenes recolectados. Todo ello permite investigar las causas seguras de contaminación en el ecosistema natural del Himalaya. Se ha comprobado la utilidad de estas herramientas de análisis para interpretar los resultados obtenidos en los análisis: 4.1 Mediante la herramienta SPSS, haciendo análisis de clústers y correlaciones lineales de Pearson se ha logrado estudiar las posibles asociaciones de dependencia entre los compuestos PAHs, nitroPAHs, oxoPAHs y elementos traza, cuantificados en las muestras de líquenes del Himalaya. 4.2 A través del uso de la herramienta Unscrambler se ha podido identificar las fuentes primarias y secundarias de éstos contaminantes mediante el estudio de patrones de distribución y el análisis de componente principales vinculando usos de tierra del sitio de muestreo y sus concentraciones de PAHs, nitroPAHs, oxoPAHs y elementos traza. 4.3 Mediante la aplicación de la herramienta MarkerLynx se ha podido reconocer marcadores específicos basados en su tR, m/z, e intensidad de los compuestos PAHs, nitro y oxoPAHs conjuntamente, para la agrupación de las muestras de líquenes del Himalaya según su actividad antropógenica y uso de tierra BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA (1) J.M. 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