Interacción patógeno-hospedador en la salmonelosis porcina. Modulación de la respuesta inmune intestinal por salmonella y mecanismos de persistencia

Zusammenfassung

1. Introducción o motivación de la tesis El establecimiento de medidas de control eficientes que reduzcan la prevalencia de Salmonella en cerdos, principalmente el serotipo S. Typhimurium, es importante para disminuir la incidencia de esta zoonosis y para mejorar la sanidad animal (EFSA, 2018). Para implementar nuevas estrategias de prevención es imprescindible conocer en profundidad la naturaleza de la interacción patógeno-hospedador. El uso de técnicas "ómicas" de vanguardia abre nuevos enfoques para abordar esta interacción en las enfermedades infecciosas (Garcia-Del Portillo and Pucciarelli, 2017; Wolf et al., 2018). El estudio de la salmonelosis generalmente se ha abordado centrándose en el comportamiento de virulencia del patógeno o la respuesta inmune del hospedador por separado (Saliba et al., 2017). Debido a esto, en esta tesis doctoral se planteó como objetivo general profundizar en el conocimiento de los mecanismos de infección de S. Typhimurium y describir las rutas e interacciones moleculares involucradas en la respuesta inmune generada por el hospedador. Para abordar este objetivo se usaron modelos de infección in vivo e in vitro. 2. Contenido de la investigación En primer lugar, se realizó un estudio histológico y molecular que evaluó factores como la colonización intestinal, la diseminación de la bacteria en heces y la persistencia de la bacteria. En él se analizaron muestras de los diferentes tramos del intestino y el tejido linfoide asociado tras una infección experimental in vivo de 30 días de duración con S. Typhimurium, definiendo 2 días post infección (d.p.i.) como el punto fuerte de la infección en todos los tejidos analizados y encontrando a 30 d.p.i. marcaje de Salmonella en las trabéculas de los NLMs (Bellido-Carreras et al., 2019). Para analizar el perfil transcripcional de patógeno y hospedador, así como la respuesta inmune del sistema gastrointestinal durante la infección, se realizaron estudios mediante dual RNA-seq de mucosa de íleon porcino y nódulos linfáticos mesentéricos regionales. En íleon infectado a 2 d.p.i. observamos la sobreexpresión de genes inflamatorios que indican la presencia de una intensa respuesta inflamatoria mediada por IL1 y TNFa, así como la subexpresión de genes regulados por la ruta de señalización de FXR relacionados con la inhibición del ciclo de absorción de las sales biliares. Para investigar en profundidad el papel de las células epiteliales intestinales porcinas, se realizó un estudio in vitro de infección de la línea celular IPI-2I tras 24 horas de infección. Los datos obtenidos del hospedador indicaron la presencia de una elevada respuesta inflamatoria mediada por NF-κB y la alteración de la expresión de genes relacionados con la ruta de la autofagia (familias ULK y ATG). Por otro lado, los genes diferencialmente expresados obtenidos del patógeno indicaron la presencia de una gran cantidad de efectores de las SPI-1 y SPI-2, a su vez englobados en funciones tan importantes como la invasión celular, la inmunomodulación y la formación de la vacuola que contiene Salmonella (SCV). Ensayos funcionales demostraron que cuando se inhibe la autofagia, la capacidad de replicación intracelular de Salmonella es limitada. La respuesta a la infección en nódulos linfáticos regionales se abordó mediante el estudio de la respuesta transcriptómica en nódulos linfáticos mesentéricos (NLMs) porcinos infectados a 2 y 30 d.p.i., con S. Typhimurium. Inicialmente, la expresión diferencial de genes relacionados con la respuesta inmunitaria fue analizada y correlacionada con cambios en la morfología tisular y carga del patógeno, revelando una abundante infiltración de células fagocíticas y la sobreexpresión de genes proinflamatorios a 2 d.p.i., que desaparece a 30 d.p.i. Se observó una fuerte respuesta inflamatoria a consecuencia del reconocimiento mediado por TLR y la activación del inflamasoma, que contribuyen a la activación de la respuesta innata y muerte celular por piroptosis, procesos que desaparecen a 30 d.p.i. Mediante ensayos de presentación antigénica, se demostró la activación de la respuesta mediada por MHC de clase I dependiente de la activación del proteasoma 3. Conclusiones En conclusión, los resultados obtenidos de este trabajo sugieren que la infección por S. Typhimurium se caracteriza por presentar una fase aguda (establecida a 2 d.p.i.), donde Salmonella está presente tanto en el tejido (íleon y NLM) como en heces (diseminación bacteriana), y una fase crónica (30 d.p.i.) donde existe un estado persistente de la infección asociado a la presencia de Salmonella en las trabéculas de los NLMs. Por otro lado, mediante dual RNA-seq observamos una importante respuesta inflamatoria del hospedador en mucosa de íleon, NLMs y en la línea epitelial intestinal porcina IPI-2I, mientras que del patógeno solo obtuvimos información relevante en el estudio in vitro de la línea epitelial porcina IPI-2I. En la mucosa de íleon ocurre además un bloqueo de la absorción biliar, a consecuencia de la infección. También demostramos que la ruta de la autofagia parece estar implicada en la estabilización de la vesícula que contiene Salmonella (SCV) en las células intestinales. En NLM los resultados obtenidos confirman la existencia del fenómeno de presentación cruzada mediada por moléculas de MHC de clase I, dependiente de la actividad del proteasoma. Estos resultados proporcionan nuevas bases para futuros estudios de la respuesta del hospedador frente a bacterias patógenas como S. Typhimurium. 4. Bibliografía Bellido-Carreras, N., Arguello, H., Zaldivar-Lopez, S., Jimenez-Marin, A., Martins, R.P., Arce, C., Morera, L., Carvajal, A., Garrido, J.J., 2019. Salmonella Typhimurium Infection Along the Porcine Gastrointestinal Tract and Associated Lymphoid Tissues. Vet Pathol, 300985819843682. EFSA 2018. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017. In EFSA Journal 2018. Garcia-Del Portillo, F., Pucciarelli, M.G., 2017. RNA-Seq unveils new attributes of the heterogeneous Salmonella-host cell communication. RNA Biol 14, 429-435. Saliba, A.E., S, C.S., Vogel, J., 2017. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Curr Opin Microbiol 35, 78-87. Wolf, T., Kammer, P., Brunke, S., Linde, J., 2018. Two's company: studying interspecies relationships with dual RNA-seq. Curr Opin Microbiol 42, 7-12.